一、动员的骨髓干细胞保护大鼠缺血心肌机制的研究（论文文献综述）
冀楠[1]（2021）在《益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究》文中研究说明背景:急性心肌梗死（Acute Myocardial infarction,AMI）发生后,左心室大小、结构、功能改变,造成心室重构。心室重构（Ventricμlar remodeling,VR）是AMI向心力衰竭发展的主要病程。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）可通过旁分泌、归巢、转化等方式缓解AMI后心肌损伤,改善心室重构。但由于AMI后内环境改变,造成BMSCs迁移效率低下。团队前期研究发现,益气活血方可改善AMI后炎性环境,改善AMI大鼠心肌损伤。但益气活血方是否可以促进BMSCs向AMI大鼠梗死部位迁移,发挥更好的心肌保护作用,值得深入研究。目的:探讨益气活血方联合骨髓间充质干细胞对心肌梗死后心室重构的干预作用,以mi RNA-210/BNIP3为切入点,从自噬-凋亡途径研究益气活血方联合干细胞对心室重构的可能的作用机制。方法:1、从SD大鼠骨髓中提取BMSCs,显微镜下观察细胞形态,流式检测细胞表面标志物。采用LAD结扎的方法建立大鼠心肌梗死模型,分为假手术组、模型组、益气活血方组、骨髓间充质干细胞组、益气活血方联合骨髓间充质干细胞组。造模2小时,心电图检测心肌缺血情况。药物干预4周后,心脏超声评价大鼠心脏结构和功能,TTC染色评价大鼠心肌梗死面积,HE染色观察大鼠心肌炎性细胞浸润情况、Masson染色观察心肌纤维组织病理改变。2、使用CM-DIL染料对BMSCs细胞膜标记染色。造模后隔天尾静脉移植入大鼠体内。干预4周后取材,运用免疫荧光检测BMSCs向梗死部位富集情况,免疫组化检测心肌组织中SDF-1/CXCR4蛋白的表达水平。3、TUNEL检测大鼠心肌细胞凋亡情况。Western Blot检测造模后各组大鼠自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62表达情况,凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达情况,目的蛋白BNIP3表达情况。RT-q PCR检测mi R-210、BNIP3 mRNA表达情况。结果:1、与假手术组相比,模型组大鼠的LVESD、LVEDD增加（P<0.01）,LVEF、LVFS降低（P<0.01）,提示模型组大鼠左室扩大,心功能下降,心脏结构改变;与模型组相比,益气活血方组、益气活血方联合骨髓间充质干细胞组的LVEDD、LVESD减小（P<0.05or P<0.01）,LVEF、LVFS升高（P<0.05 or P<0.01）,提示此两组可减轻心肌梗死所致的大鼠心脏损伤,减轻大鼠心脏结构改变;与模型组比较,骨髓间充质干细胞组的LVESD减小（P<0.01）,LVFS、LVEF升高,LVEDD减小,但差异无统计学意义（P>0.05）。与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组与骨髓间充质干细胞组LVESD、LVEDD增加（P<0.05 or P<0.01）,LVEF、LVFS降低（P<0.05 or P<0.01）。提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组对梗死心肌的保护作用最为显着。TTC染色结果显示:与假手术组相比,模型组梗死面积显着增加（P<0.01）。与模型组相比,各给药组梗死面积减少（P<0.05 or P<0.01）。与益气活血联合骨髓间充质干细胞组相比,其余两给药组梗死面积增大（P<0.05 or P<0.01）。HE染色结果显示:假手术组大鼠心肌细胞形态正常,细胞核结构清晰,居于中央,肌丝着色均匀,排列整齐规则,呈正常心肌细胞形态;与假手术组比较,模型组大鼠病变程度严重,心肌细胞形态不规则,排列紊乱,细胞核深染,炎性细胞浸润增多;与模型组比较,各给药组大鼠梗死范围缩小,心肌结构改变减轻,肌丝排列较规则,炎性细胞浸润和水肿减少。Masson染色结果显示:假手术组心肌细胞排列整齐,极少纤维组织沉积;模型组病变最为严重,染色显示在心肌梗死边缘区心肌细胞肥大,纤维组织沉积严重,排列紊乱,可见大面积蓝色纤维化;与模型组比较,各给药组显示胶原纤维沉积减少,心肌排列整齐。2、AMI大鼠造模后隔天经尾静脉移植BMSCs,荧光显微镜下观察其迁移情况,可见心肌组织中橙红色荧光,BMSCs向心肌梗死部位富集。免疫组化结果显示:与骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方联合骨髓间充质干细胞组SDF-1蛋白表达增加（P<0.05）,CXCR4表达无统计学差异。3、TUNEL染色显示假手术组未见明显阳性细胞核染色,阳性细胞核染色多见于模型组。与模型组相比,给药组阳性细胞核染色数量明显减少。凋亡相关蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌Bax蛋白表达上调（P<0.01）,Bcl-2蛋白表达下调（P<0.01）,Caspase-3表达上调（P<0.01）,提示凋亡激活;与模型组比较,各给药组可下调Bax蛋白表达（P<0.01）,益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可下调Caspase-3蛋白表达（P<0.01）,上调Bcl-2蛋白表达（P<0.05）,骨髓间充质干细胞组Bcl-2蛋白表达有上调趋势,Caspase-3蛋白表达有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组Bax、Caspase-3蛋白表达上调,（P<0.01 or P<0.05）,Bcl-2表达下调（P>0.05）,提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组抑制凋亡效应最显着。自噬相关蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌P62蛋白表达上调（P<0.05）,LC3B、Beclin-1蛋白表达下调,（P<0.01 or P<0.05）提示自噬激活;与模型组比较,各给药组可下调P62蛋白表达（P<0.01）,上调Beclin-1蛋白表达（P<0.01）,益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可上调LC3B蛋白表达（P<0.01 or P<0.05）,骨髓间充质干细胞组LC3B蛋白表达有上调趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组P62蛋白表达上调（P<0.01 or P<0.05）,LC3B、Beclin-1表达下调（P<0.01 or P<0.05）,提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组诱导自噬效应最显着。BNIP3蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌BNIP3蛋白表达上调（P<0.01）;与模型组比较,各给药组可下调BNIP3蛋白表达（P<0.01 or P<0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组BNIP3蛋白表达上调（P<0.01）。mi R-210与BNIP3 Mrna PCR检测结果显示,与假手术组比较:模型组大鼠心肌mi R-210表达下调（P<0.01）,BNIP3 mRNA表达水平上调（P<0.01）;与模型组比较:益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可上调mi R-210表达（P<0.01 or P<0.05）,骨髓间充质干细胞组mi R-210表达有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）,各给药组可下调BNIP3 mRNA表达情况（P<0.01）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比:益气活血方组和骨髓间充质干细胞组mi R-210表达下降,（P<0.01）,骨髓间充质干细胞组BNIP3 mRNA表达水平上升（P>0.01）,益气活血方组BNIP3 mRNA有上升趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。提示益气活血方可能通过mi R-210/BNIP3通路发挥作用,且益气活血方联合骨髓间充质干细胞效用最为显着。结论:1、益气活血方联合骨髓间充质干细胞能够提高心梗后射血分数,改善大鼠的心脏结构,减轻心脏损伤。2、益气活血方通过干预SDF-1/CXCR4轴增加BMSCs向梗死区富集效率。3、益气活血方联合骨髓间充质干细胞可能通过调控mi RNA-210/BNIP3轴,影响心肌细胞自噬-凋亡,发挥抑制VR机制。
李记泉[2]（2020）在《针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究》文中认为目的:本文以急性心肌缺血（Acute Myocardial Ischemia,AMI）大鼠为研究对象,以针刺联合骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs）静脉移植为干预手段,旨在探讨针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。材料与方法:1.BM-MSCs的分离、培养、传代、鉴定和标记:健康雄性SD大鼠3只（SPF级,4周龄,体重150-160g）,采用7%水合氯醛（5 m L/kg）腹腔注射麻醉,浸泡于75%酒精消毒5min,无菌条件下取胫骨、股骨,PBS缓冲液冲洗出骨髓制成单细胞悬液,离心后接种于培养瓶,放置于培养箱中采用全骨髓贴壁法培养,及时更换培养基,待细胞铺满培养瓶底部并融合成单层时,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1:2传代培养,显微镜观察细胞形态变化,取第三代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标记（CD29、CD73、CD90、CD44、CD45）,并取第三代细胞Brd U标记后采用荧光显微镜观察阳性细胞标记率。2.AMI大鼠模型的制备:60只健康雄性SD大鼠,腹腔注射7%水合氯醛（5 m L/kg）麻醉,通过结扎冠状动脉左前降支复制AMI大鼠模型,将存活的大鼠随机分为模型组、干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组,每组10只;同时另有15只大鼠仅在相同部位穿刺手术缝合线而不结扎,随机挑选术后存活大鼠10只作为假手术组。3.针刺联合BM-MSCs静脉移植干预AMI大鼠:造模结束后1小时,干细胞组、针刺联合干细胞组大鼠经尾静脉注射0.5ml的BM-MSCs（2×106个/ml）,同时其余各组注射同等剂量的生理盐水。对针刺组、针刺联合干细胞组大鼠采取电针双侧内关、心俞穴,刺入皮下深度2-3mm,疏密波,频率2Hz,强度2m A左右,以局部肌肉出现轻度震颤收缩为度,留针30min,24h治疗一次,共治疗10次;其他各组不针刺,但在同时同地以同样方式进行抓取和固定。期间观察各组大鼠体重、毛发、体态、饮食、二便、运动等一般情况。治疗结束后检测各组大鼠心电图、心脏超声,随即处死各组大鼠,取腹主动脉全血,分离出血清备用;同时快速取出心脏,生理盐水冲洗干净,每组随机挑选1个心脏样本,在缺血区域切薄片5片,用于大鼠心肌缺血面积的测定,其他心脏样本—80℃超低温冰箱冻存备用。本文分两个部分讨论针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。（1）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究观察BM-MSCs传代培养时的形态学特征与变化,分析BM-MSCs的鉴定和标记结果,采集大鼠心电图和心脏超声数据并分析,采用氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法测定AMI后各组大鼠的心肌缺血面积。（2）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色法检测AMI后各组大鼠心肌细胞形态和炎症浸润情况;蛋白质印迹法（Western Blot,WB）技术检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、VEGF、b-FGF、TGF-β蛋白的相对表达量;酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）技术检测大鼠心肌TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10蛋白的相对表达量。结果:1.与假手术组比较,模型组大鼠LVDd、LVDs明显升高（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠LVDd、LVDs、LVEF、LVFS无明显差异（P>0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）。2.假手术组大鼠未见心肌缺血;与假手术组比较,模型组大鼠心肌缺血面积明显升高（P<0.01）,缺血区面积占左心室总面积的18.39%;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌缺血面积比例无明显变化,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积明显高于针刺组、干细胞组（P<0.01）。3.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01或P<0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）。4.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）。5.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显降低（P<0.01）;针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显低于针刺组、干细胞组（P<0.01）。6.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）。7.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）。结论:1.针刺联合BM-MSCs移植能够显着改善AMI大鼠心电图和心脏超声变化,降低AMI大鼠左心室心肌缺血面积,提高AMI大鼠心脏功能,为临床治疗本病提供了新思路。2.针刺联合BM-MSCs移植能够通过下调AMI大鼠NF-κB表达,降低炎症因子TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8水平,以及上调抑炎因子IL-10水平,减轻AMI后过度表达的炎症反应,从而减轻心肌细胞坏死;通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达,从而减少AMI后心肌细胞凋亡;通过调节细胞生长因子VEGF、b-FGF、TGF-β表达,诱导内皮细胞形成,从而改善心肌供血。
夏文庆[3]（2020）在《骨髓干细胞动员抑制TGF-β非经典通路对抗大鼠心肌纤维化的研究》文中认为研究背景近年来随着心血管病患病率的持续上升,冠心病、肺心病、心力衰竭等疾病对居民生活的影响不容小觑,心血管病相关的心肌纤维化、心室重塑等改变也越来越被临床研究所重视,且不仅在心脏疾病中,糖尿病人群也会出现血糖相关的心肌纤维化。心肌纤维化的病理生理改变是细胞外基质成分在心肌间质中过量沉积,导致心室壁弹性减弱,收缩及舒张功能受损,最终引起心力衰竭。细胞外基质沉积包括胶原增生、成纤维细胞大量增殖两方面,在心血管疾病的晚期,异常增生的胶原纤维相互交联,加重心肌纤维化。因此,预防心肌纤维化和减缓其进展,在慢性心脏疾病的治疗中具有重要的临床意义。心肌纤维化的机制错综复杂,相互影响,在对心肌纤维化信号通路的研究中发现,TGF-β是促纤维化过程中最重要的分子,被认为是心肌梗死后,组织由炎症反应向瘢痕组织转变的开关,其通过Smad蛋白依赖通路和非Smad蛋白依赖通路,刺激细胞因子和信号通路,进而影响胶原纤维等成分改变。TGF-β家族中,研究最多的是TGF-β。TGF-β是一个多效因子,其生理功能即使在同样的细胞里也有可能不同,甚至相反。目前发现哺乳动物中TGF-β有3种亚型,TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,3种亚型在体内具有不同的功能。TGF-β和TGF-βR结合后,可激活下游的信号分子级联反应,参与分化、凋亡、炎症反应等过程。在TGF-β信号通路中,以Smad蛋白依赖的经典通路为主,活化的TGFβR与R-Smad蛋白结合,最终移位到细胞核内,调控靶向基因的转录过程。除此以外,不依赖Smad蛋白的信号通路在TGF-β反应中也有重要的作用,目前已发现的非经典信号通路有ERK-MAPK信号通路、TAK1介导的JNK/p38MAPK信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路等,这些信号通路通过与活化的TGF-β受体结合后级联调控,参与TGF-β介导的上皮间质转换、凋亡、纤维化等过程。除了介导信号通路,TGF-β还通过与其他的细胞因子互相作用,参与促纤维化的过程。因此,作为心肌纤维化中的主要因子,对抗TGF-β及其介导的信号通路无疑成为防范心肌纤维化进展的重要靶点。丝裂原活化蛋白激酶MAPK介导的p38MAPK信号通路在早期即发现有促进胶原纤维合成的作用,经典的MAPK是一个三级级联磷酸化过程,活化的TGF-βR激活TAK1,即MAP3K后,下游的MKKs、p38被依次磷酸化激活,调控Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。粒细胞集落刺激因子G-CSF是一种有效的干细胞动员剂,通过募集血液中的骨髓干细胞,并动员到心肌坏死部位后,分化为血管内皮细胞,促进血管再生,减少凋亡细胞表达,在急性心梗、心力衰竭方面发挥保护心脏的作用。G-CSF动员干细胞治疗心梗后心肌纤维化的机制目前主要集中于Smad依赖的信号通路,而对于非Smad依赖通路是否有调控作用目前尚不清楚。研究目的以Wistar大鼠为研究对象,异丙肾上腺素Iso构建心肌纤维化模型后,给予G-CSF皮下注射,观察动员治疗对大鼠心肌纤维化的影响。检测心肌组织中TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达情况,探讨G-CSF对抗心肌纤维化的可能机制,为干细胞动员在临床上的应用提供科学依据。研究方法1.22只Wistar大鼠标号,每日固定时间背部皮下注射Iso4mg/kg-1.d-1,连续10天,构建心肌纤维化模型;2.20只大鼠随机分为对照组（control group）和动员组（GT group）,G-CSF用生理盐水稀释后,动员组背部皮下注射G-CSF 50μg/kg-1.d-1,连续5天,对照组皮下注射生理盐水,末次给药结束后正常喂养4周;3.动员前及动员后第5天,尾静脉采血稀释后用血细胞计数仪检测外周血白细胞个数;4.动员第5天,大鼠尾静脉采血后,使用密度梯度离心法低温高速离心,吸取单个核细胞层后,用于细胞培养以及细胞的流式鉴定;5.大鼠取材前一天行心脏超声,了解心脏功能;6.所有大鼠麻醉后,腹主动脉采血后静置,高速离心后取上层血清分装,用于Elisa检测BNP含量;7.大鼠心脏在最大横径下方约2mm处横切,上半部分置于多聚甲醛中固定,下半部分剪去右心室及室间隔部分,置于冻存管内液氮冻存;8.心肌组织在固定24h后,用于HE染色、Masson染色以及免疫组织检测;9.Western Blot 检测心肌组织中 ColI、TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达。实验结果1.Iso诱导大鼠心肌纤维化改变Iso连续皮下注射10天后,心肌组织HE染色显示,正常大鼠心肌结构整齐无异常胶原增生,注射Iso的大鼠心肌细胞结构错乱,间质胶原纤维大量增生,成纤维化改变。2.外周血粒细胞检测和鉴定G-CSF能动员骨髓中的造血干细胞和骨髓干细胞,因此可通过计数外周血白细胞WBC的数量,了解骨髓动员的情况。根据WBC计数结果,GT组在动员治疗前后,外周血粒细胞数量明显升高,组内比较有显着性差异（P<0.01）;动员第5天后,GT组的粒细胞计数较对照组相比也明显升高,组间有显着差异（P<0.01）;而对照组在动员前后,外周血粒细胞计数无明显变化。对动员第5天的外周血分离培养后,行流式细胞检测结果显示:外周血粒细胞表面标志CD29、CD90强阳性,CD45阴性,符合骨髓干细胞表面抗原表达的特点,由此证明粒细胞刺激因子动员后,外周血中的单个核细胞主要是骨髓干细胞。3.血清Elisa检测BNP含量动员治疗后,大鼠血清BNP的含量在GT组低于对照组,两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。4.心肌病理学形态检测Masson染色显示与对照组相比,GT组心肌间质的胶原沉积程度显着减轻;使用Image-pro软件测量并计算胶原容积分数CVF值,GT组CVF值低于对照组,两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。5.心肌III型胶原纤维表达情况心肌组织免疫组化结果显示:对照组心内膜下可见明显阳性表达,Ⅲ型胶原蛋白在间质内弥漫性增生;GT组阳性表达减少,胶原蛋白沉积减轻。6.Western Blot 检测心肌组织 Col I、TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达与对照组相比,GT组的I型胶原蛋白表达减少,纤维化程度减轻;TGF-β、TAK1蛋白以及MKK3、p38MAPK蛋白表达下降,用Image-pro软件对两组蛋白条带进行测量后显示,两组间蛋白表达差异P<0.05,差异具有统计学意义。实验结论1.Wistar大鼠皮下注射Iso 4mg/kg-1.d-1,连续10天,大鼠心肌组织能观察到明显的纤维化改变,该建模方式稳定,且动物存活率高。2.心肌纤维化的大鼠在G-CSF动员治疗后,外周血的干细胞数量明显升高,并且升高的细胞以骨髓干细胞为主。3.G-CSF动员治疗可以改善心肌纤维化大鼠的心脏功能,并且减少间质的胶原纤维沉积,减轻心肌纤维化的程度。4.通过检测心肌组织的TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达发现,GT组的TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达减少,初步证实G-CSF动员干细胞对抗心肌纤维化的机制是通过抑制TGF-β介导的TAK1-MKK3-p38MAPK 通路实现的。
张妮[4]（2019）在《降香新黄酮latifolin促进骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病心肌修复作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs）移植治疗心肌梗死被认为是一种有效的治疗方法,然而炎性微环境导致移植的BM-MSCs生存率和分化率低,限制了其疗效,提高BM-MSCs的生存率和分化能力以提高BM-MSCs移植治疗心肌梗死疗效十分重要。Latifolin是从中药降香中分离出来的单体化合物,研究报道表明latifolin具有抗炎作用,前期研究发现latifolin对心肌细胞具有保护作用,可降低心肌组织炎细胞浸润,提高心功能。因此,推测latifolin可通过改善炎性微环境提高BM-MSCs生存率和增强BM-MSCs定向分化能力,进而提高BM-MSCs移植治疗心肌梗死疗效。本研究探索latifolin对BM-MSCs生存率和心肌定向分化的作用,以达到增强BM-MSCs移植治疗缺血性心脏病目的,为心肌梗死细胞治疗和心肌再生研究奠定基础。研究方法:1.采用全骨髓提取法收集大鼠BM-MSCs,倒置显微镜观察培养细胞形态;采用流式细胞仪检测BM-MSCs表面抗原CD29、CD90、CD34和CD45。2.采用噻唑蓝（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium,MTT）法和Annexin V-FITC/PI双染法测定缺血、缺氧和炎性微环境对BM-MSCs活力和凋亡的影响;采用RT-PCR和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性因子表达和分泌影响;MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法测定latifolin对BM-MSCs的活力和凋亡作用;ELISA测定latifolin对BM-MSCs炎性因子的影响。3.将BM-MSCs分为正常组、5氮杂胞苷（5-azacytidine,5Aza）诱导组、5Aza+latifolin诱导组和latifolin诱导组,显微镜下观察BM-MSCs向心肌细胞分化的形态学变化;RT-PCR检测心脏特异性基因转录因子GATA4、NKX2.5和肌细胞增强因子-2C（myocyte enhancer factor2C,MEF2C）的表达;免疫荧光染色检测心脏特异性蛋白α-肌动蛋白（alpha sarcomeric actin,a-actinin）和心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）的表达;透射电镜观察各组骨髓间充质干细胞分化的超微结构。4.（1）体外建立BM-MSCs和H9c2共培养体系,实验分组分别为:H9c2正常组;H9c2模型组;H9c2+MSC共培养组;H9c2+MSC共培养+药物（2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL）组,对共培养体系进行缺血缺氧和炎症造模处理,经latifolin干预后,采用Annexin V/PI测定H9c2凋亡情况;（2）冠状动脉左前降支结扎建立急性心肌梗死模型,实验共分成9组:假手术组、MI模型组、MSC移植组、MSC移植+latifolin（25,50,100 mg/kg）组、latifolin（25,50,100 mg/kg）组,PowerLab监测冠状动脉左前降支结扎前后心电图ST段变化以评价造模情况;检测给药7d血清中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzyme MB,CK-MB）含量以评价心肌损伤情况;心脏超声评价心功能;TTC染色法测定梗死面积;HE染色评价心肌病理损伤;Masson染色评价心肌胶原纤维化;免疫荧光法检测BM-MSCs生存率和分化情况;免疫组化测定CD68和MPO阳性表达数量;WB检测心肌组织中IL-6、p-NF-κB、β-catenin和缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）蛋白表达情况。结果:1.倒置显微镜观察BM-MSCs呈纺锤形,放射性及螺旋生长;流式细胞仪检测BM-MSCs表面抗原CD29、CD90、CD34和CD45表达率分别为:99.8%、99.5%、0.2%、4.7%。2.（1）MTT和Annexin V-FITC/PI检测结果显示,氧糖剥夺6h和12h后细胞活力明显增强,氧糖剥夺24h后细胞活力显着降低,在氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor,TNF-α）及内毒素（lipopolysaccharide,LPS）条件下6、12、24h细胞活力显着降低;（2）ELISA和RT-PCR结果显示,氧糖剥夺6、12 h降低上清中白细胞介素-6（interleukin 6,IL-6）、白细胞介素-10（interleukin 10,IL-10）水平和细胞中IL-6、IL-10、TNF-α、核转录因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）基因表达;氧糖剥夺+TNF-α及LPS条件6、12 h显着升高上清中IL-6、TNF-α水平和细胞中IL-6、TNF-α、NF-κB基因表达;（3）MTT和Annexin V/PI结果显示,10μg/mL剂量下latifolin显着增加氧糖剥夺+TNF-α条件下BM-MSCs活力,显着降低其凋亡,latifolin显着降低氧糖剥夺+TNF-α条件的BM-MSCs分泌的IL-6、TNF-α水平。3.（1）BM-MSCs在单独用5Aza诱导和latifolin联合5Aza诱导2周后表现出形态上变化,其细胞膨大凸起,在第3周和第4周细胞间出现连接,形成肌管样结构;（2）RT-PCR结果显示,5μg/mL latifolin联合5Aza诱导组显着升高BM-MSCs特异性基因GATA4,NKX2.5和MEF2C表达;（3）免疫荧光染色的结果显示,5Aza诱导组及latifolin联合5Aza诱导组存在明显的心脏特异性蛋白质a-actinin和cTnI的表达;（4）透射电镜结果显示,latifolin联合5Aza诱导组的BM-MSCs分化后细胞质中有明显的心房颗粒、肌丝、丰富的线粒体和粗面内质网。4.（1）latifolin促进BM-MSCs修复受损心肌细胞的作用:Annexin V/PI测定结果显示,与正常组比,H9c2模型组细胞凋亡比例显着性升高;与模型组比较,H9c2+MSC共培养组、H9c2与MSC共培养+药物（10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL）组均能显着性降低H9c2凋亡比例;与H9c2+MSC共培养组比较,H9c2+MSC+10μg/mL给药组能显着降低H9c2凋亡。（2）latifolin促进BM-MSCs移植治疗心肌梗死作用及机制研究:（1）PowerLab检测结果显示,心肌梗死后心电图有ST段明显抬高表现;（2）给药7d后,MSC+latifolin高剂量组显着降低LDH含量,显着降低CK-MB含量;（3）超声结果显示,MSC+latifolin高剂量组显着升高左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左室缩短分数（Left ventricular shortening fraction,LVFS）和心输出量（Cardiac output,CO）,显着提高心功能;（4）TTC染色结果显示,模型组梗死面积达到39%,单独MSC组及MSC与latifolin联合组均能显着性降低梗死面积;（5）HE染色结果显示,MSC+latifolin高剂量组明显改善梗死周边炎症细胞浸润和肌丝溶解情况;（6）Masson染色结果显示,MI造模后梗死区呈大面积蓝色染色,胶原纤维化明显,MSC+latifolin中、高剂量组显着减少心肌胶原纤维化面积;（7）免疫荧光检测结果显示,MSC+latifolin高剂量组显着增加BM-MSCs在心肌组织中的生存率和分化率;（8）免疫组化测定结果显示,MSC移植组+latifolin低、中、高剂量组和latifolin低、中、高剂量组均能显着降低CD68阳性表达数量,对MPO阳性表达数量无显着影响;（9）WB检测结果显示,MSC+latifolin高剂量组显着降低心肌组织中IL-6、p-NF-κB和HIF-1α蛋白表达,显着升高β-catenin蛋白表达。结论:采用全骨髓提取法获得的细胞为纯度较高的BM-MSCs,降香新黄酮latifolin通过改变炎症微环境显着提高BM-MSCs生存率,latifolin显着促进BM-MSCs向心肌细胞分化,latifolin显着促进BM-MSCs修复受损心肌细胞;经动物实验证实,latifolin通过降低炎性巨噬细胞浸润改善心肌组织中炎性微环境,显着提高在体BM-MSCs移植生存率和心肌细胞分化率,使受损心肌组织明显得到修复,latifolin有效增强BM-MSCs移植治疗心肌梗死效果,其作用机制可能与HIF-1α/NF-κB/β-catenin通路有关。
王璐[5]（2019）在《淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究》文中进行了进一步梳理干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,具有十分广阔的应用前景,已被广泛应用至多种疾病的临床研究中,但是临床上移植入体内的干细胞存活率低,限制了其推广应用。因此,亟需新的治疗策略改进干细胞抵御体内恶劣微环境的能力。天然药物独具优势,前期实验发现淫羊藿素（icaritin,ICT）预处理后的人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）治疗急性肝衰竭大鼠,死亡率进一步降低,肝脏病理、肝功能得到进一步改善,但是内在机理尚不清楚。预实验发现ICT可以增加体外培养的hUC-MSCs的细胞活力,调节多种细胞因子的分泌,并减少细胞的凋亡,电镜下可见ICT减少了自噬小体包裹的线粒体数量,因此,本研究将从细胞凋亡与线粒体自噬入手,探索淫羊藿素影响人脐带间充质干细胞的机制,为中药联合干细胞疗法提供理论依据。目的:本研究首先通过文献综述,为实验提供理论支持;随后在体外采用无血清培养部分模拟体内微循环障碍的环境,使用ICT干预hUC-MSCs,探索其是否具有抗凋亡作用,并深入研究是否通过HGF（肝细胞生长因子）/c-Met通路发挥作用;观察ICT能否干预hUC-MSCs的线粒体自噬过程;同时采用蛋白质谱,分析ICT预处理后的hUC-MSCs的差异表达蛋白,并进行GO分析、KEGG分析、蛋白互作分析等生物信息学分析,评估淫羊藿素参与的生物学过程。方法:人脐带间充质干细胞无血清培养72小时作为基本的造模方式,模拟微循环障碍的体内环境。不同浓度的ICT干预造模细胞,用MTS法测定其0D值,筛选最佳处理浓度。BrdU掺入试验检测Control组（正常培养组）、Serum free组（无血清培养组）、ICT组（淫羊藿素组）、HGF组（肝细胞生长因子组）的细胞增殖率。ELISA法检测ICT促进hUC-MSCs的HGF分泌情况。WB与qRT-PCR法检测ICT影响hUC-MSCs的c-Met受体表达情况。转染构建c-Met+MSCs,通过qRT-PCR和WB检验其转染效率。使用CCK8法筛选c-Met受体抑制剂克唑替尼（crizotinib）的最佳作用浓度。采用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测,评估各组细胞凋亡率。qRT-PCR与WB检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3、Bax的表达。MTS法检测不同浓度的自噬抑制剂3MA对造模细胞的影响。使用qRT-PCR、WB以及免疫荧光显微镜检测线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基II（MT-C02）、自噬相关蛋白LC3B的表达情况。透射电镜观察各组细胞的超微结构,重点观察其线粒体自噬水平。采用qRT-PCR筛选ICT干预hUC-MSCs线粒体自噬的相关通路。使用JC-1膜电位检测试剂盒检测膜电位情况。采用蛋白质谱进行各组细胞差异蛋白的生物信息学分析。结果:1.不同浓度的淫羊藿素处理无血清培养hUC-MSCs,各处理浓度均提高了其细胞活力,但是仅50ng/ml（0.1uM）、100ng/ml具有统计学意义（P<0.05）。选择50ng/ml为最佳处理浓度进行后续实验。BrdU检测显示较Control组,Serum free组增殖率下降（P<0.05）,而使用ICT或者HGF均提高了细胞增值率（P<0.05）。2.人脐带间充质干细胞本身可分泌HGF,也表达HGF的受体c-Met,而ICT能够促进其表达更高水平的HGF与c-Met受体（P<0.05）。构建c-Met+MSCs后,WB与qRT-PCR法证实了基因转染成功。根据细胞抑制率,筛选4 u M为克唑替尼（c-Met受体抑制剂）的最佳处理浓度。MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,c-Met+MSCs的细胞凋亡率显着降低（P<0.01）,克唑替尼处理后,细胞凋亡率显着增高（P<0.01）,提示HGF/c-Met通路对于MSCs具有抗凋亡作用。WB显示,对比MSCs组,c-Met+MSCs组Bcl-2的表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,克唑替尼则使Bcl-2蛋白水平降低,Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示HGF/c-Met通路通过调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。3.MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,ICT或HGF处理后,MSCs凋亡率显着降低（P<0.05）。当使用c-Met受体抑制剂克唑替尼时,拮抗了 ICT的抗凋亡作用,差异有统计学意义（P<0.01）。这表明克唑替尼可以抑制ICT对MSCs的保护作用,ICT对MSCs的抗凋亡作用与HGF/c-Met通路相关。WB显示,ICT或HGF处理后的MSCs的Bcl-2表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,对比ICT组,加用克唑替尼后可使Bcl-2蛋白水平降低,使Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示ICT通过HGF/c-Met通路调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。4.低浓度的自噬抑制剂3-MA对造模细胞的活性具有促进作用（P<0.05）,而高浓度的自噬抑制剂3-MA抑制了细胞活性（P<0.01）。提示无血清培养条件下,适度的抑制细胞自噬有利于细胞的存活,而过度的抑制细胞自噬则会降低细胞活力,不利于细胞存活。5.与Control组比较,Serum free组MSCs的线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ（MT-C02）均会减少,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率提高,线粒体膜电位降低,提示线粒体自噬水平被上调,电镜可见细胞内“线粒体自噬体”（被自噬小体包裹的线粒体）显着增多,损伤线粒体增加,细胞形态不佳,证实了无血清培养增加了线粒体自噬;而ICT或者HGF干预后上述线粒体蛋白表达增加,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率降低,线粒体膜电位升高,提示线粒体自噬水平被下调。电镜可见胞内“线粒体自噬体”减少,损伤线粒体减少,细胞形态得到一定的改善,证实了ICT和HGF均减少了线粒体自噬。6.采用qRT-PCR进行Pink1/Parkin通路,FUNDC1通路以及Bnip3/Nix通路的筛选,结果如下:Pink1、Bnip3的mRNA与前述线粒体自噬趋势相符,Nix、FUNDC1的mRNA呈现出相矛盾的趋势。7.蛋白质谱分析:通过GO分析,发现Control组与Serum free组的差异蛋白,以及ICT组与Serum-free组之间,HGF组与Serum free组之间的差异蛋白,均参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程（P<0.05）。对ICT组与Serum free组的差异蛋白进行分析,AKT1位于蛋白互作中心节点位置,KEGG分析PI3K-AKT通路具有统计学意义,可作为研究的重点通路。对于HGF组与Serum free组之间的差异蛋白进行分析,筛选出NF-κ B通路作为研究重点通路。结论:1.淫羊藿素能够通过HGF/c-Met通路降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的凋亡率,与调节Cleaved Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达水平有关。2.淫羊藿素或肝细胞生长因子均可降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的线粒体自噬水平,减少损伤线粒体数目,改善细胞形态,增加线粒体蛋白tomm20、timm23、MTC02的表达,提高线粒体膜电位。3.蛋白质谱分析发现淫羊藿素或肝细胞生长因子介导的差异蛋白参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程,对于ICT,PI3K-AKT通路可作为研究重点通路,对于HGF,NF-κ B通路可作为研究重点。
蔡昊[6]（2019）在《三七皂苷R1预处理提高干细胞移植治疗心肌梗死的作用及其机制》文中提出目的干细胞移植治疗心肌梗死（myocardial infarction,MI）作为极具潜力的治疗手段,目前还面临着移植后细胞存活和分化效率低下的问题。针对心梗后缺血缺氧的微环境,提高细胞移植后生存率、促进干细胞分化成熟是目前研究的关注焦点。作为两种最有临床应用价值的干细胞,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）有较强的外分泌功能,在移植后能通过该途径促进组织修复,目前已被广泛应用于临床研究。而诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PSs）具有更接近胚胎干细胞的自我更新和多向分化潜能,能够有效诱导分化为心肌细胞,称诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（induced pluripotent stem cells-cardiomyocytes,i PS-CMs）,并可避免伦理问题,在未来有着更广阔的临床应用前景[1]。本研究通过三七皂苷R1（Notoginsenoside R1,NGR1）预处理以提高MSCs、i PS-CMs的存活和外分泌功能,并探讨经NGR1预处理的MSCs和i PS-CMs移植治疗MI的作用及其内在机制,为临床应用干细胞治疗MI等缺血性心脏病提供理论和实验依据。方法体外培养MSCs,经NGR1预处理后,通过H2O2进行氧化应激模型构建,利用CCK8和TUNEL分别检测NGR1对细胞增殖活性和对抗H2O2诱导损伤的的影响,并通过试剂盒检测细胞内ROS含量,Western Blot检测p-Akt、p-CREB、p-Fox O1的水平,ELISA检测细胞培养液中的IGF-1、VEGF、SCF、b FGF含量,q RT-PCR检测细胞培养液外泌体中mi R-21表达水平,并对各组细胞进行转录组测序,在体外探讨NGR1对MSCs的保护作用。体外培养i PSs,并诱导其向心肌细胞分化,利用CCK8检测NGR1对i PSs-CM增殖的的影响,Western Blot检测p-Akt的水平。构建大鼠、裸鼠MI模型,分别移植NGR1预处理的MSCs或i PS-CMs,通过超声心动图检测治疗后各组动物心功能,经Masson三色染色测定心肌梗死面积和梗死区胶原纤维沉积,通过TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光染色检测梗死区HNA、c Tn T、Cx43、v WF、α-SMA、Lyve-1的表达,q RT-PCR检测梗死心肌组织中IGF-1、VEGF、VEGFC、SCF、b FGF的表达,明确NGR1预处理后的MSCs或i PS-CMs移植治疗效果及可能的机制。结果不同浓度NGR1能够促进MSCs增殖。在300μM的H2O2刺激条件下,0.1μM的NGR1处理24h或48h均可显着保存细胞活性,保护细胞免受H2O2造成的损伤,1μM的NGR1和10μM的NGR1处理也可以提高MSCs的细胞活性,但明显低于0.1μM的NGR1。0.1μM的NGR1是保护MSCs的最佳浓度。NGR1处理MSCs后,p-Akt、p-Fox O1的水平明显增加,p-CREB水平无明显变化。加入PI3K抑制剂LY294002后,各组各时间点p-Akt水平相近,p-Fox O1水平相近。DAPI和TUNEL染色显示,300μM的H2O2处理后可以显着地增加凋亡的MSCs数量,并显着提高MSCs中的ROS含量,而NGR1可以明显降低MSCs的凋亡和ROS水平,而加入PI3K抑制剂LY294002后,凋亡MSCs的数量显着增加,ROS含量升高。NGR1可以促进体外培养的MSCs释放IGF-1、VEGF、SCF、b FGF,LY294002可以抑制NGR1对以上细胞因子的促进作用。NGR1处理还能够提高MSCs外泌体中mi R-21的水平。转录组测序结果表明,NGR1的影响会富集到的信号通路包括合成和代谢相关的通路和凋亡信号通路,如:脂肪酸代谢、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、p53信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路等。其他一些通路也明显被激活,如内吞、细胞周期等。MSCs移植可以提高MI大鼠EF和FS值,并降低LVIDs和LVESV值。NGR1预处理的MSCs移植组中EF和FS值最高,LVIDs和LVESV值最低。Masson三色染色检测发现,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均可降低梗死面积和胶原沉积。NGR1预处理的MSCs移植组梗死面积和梗死区胶原纤维沉积显着低于PBS组和MSCs移植。PBS组大鼠梗死区室壁厚度明显减少,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均能增加梗死区室壁厚度,并且NGR1预处理的MSCs移植组大鼠中梗死区室壁厚度明显高于MSCs移植组。通过GFP示踪移植细胞的存活发现,NGR1预处理的MSCs移植组中MSCs数量明显高于MSCs移植组。TUNEL染色检测各组梗死区凋亡细胞的数量发现,PBS组中凋亡细胞数量最多,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均可减少细胞凋亡。免疫荧光染色检测v WF和α-SMA并统计各组血管密度发现,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均可提高梗死区微血管数目和α-SMA阳性血管数目。与MSCs移植组相比,NGR1预处理的MSCs移植组中梗死区微血管数量和α-SMA阳性血管数量明显增多。ELISA检测各组梗死区心肌组织中IGF-1、SDF-1和VEGF的含量发现,与PBS组相比,MSCs移植可提高IGF-1、SDF-1和VEGF的水平,而NGR1预处理的MSCs移植组中各细胞因子的水平明显高于MSCs移植组。通过对GSK3和Wnt信号通路的抑制和控制细胞浓度可以有效诱导hi PSs分化为hi PS-CMs,免疫荧光染色检测到诱导分化后的细胞表达c Tn T。在6孔板中最佳诱导条件为100万细胞/孔,CHIR99021浓度为6μM。经NGR1处理后,各组间OD值无明显差别。但随着药物处理时间的增加,0.1μM、1μM、10μM NGR1均能够表现出促进hi PS-CMs增殖的趋势。药物处理72h后,0.1μM组促进趋势最为明显。NGR1处理hi PS-CMs后,p-Akt水平有明显提升。加入PI3K抑制剂LY294002后,p-Akt的活化受到显着抑制。hi PS-CMs移植后2周时,注射i PS-CMs组（IC）,其心功能指标EF、FS相较于MI组有明显的改善,LVEDV、LVIDd相较于Control组和MI组有所升高,LVESV、LVIDs相较于MI组有所降低。注射经NGR1预处理的i PS-CMs组（NIC）,其心功能指标EF、FS优于IC组,LVEDV、LVIDd、LVESV、LVIDs指标的恢复趋势也优于IC组。4周时,NIC组其心功能指标EF、FS相较于MI组亦有着明显的改善,并优于IC组。Masson三色染色检测发现,IC组和NIC组梗死面积和胶原沉积均降低。MI组裸鼠梗死区室壁厚度明显减少,hi PS-CMs移植和NGR1预处理的i PS-CMs移植均能增加梗死区室壁厚度。NIC组裸鼠中梗死区室壁厚度明显高于IC组。TUNEL染色结果显示,hi PS-CMs移植可以降低凋亡数量,而0.1μM NGR1预处理的hi PS-CMs移植相较于hi PS-CMs移植,可以更明显地地减少心脏组织的细胞凋亡。HNA和c Tn T染色结果显示,NGR1预处理可以促进移植hi PS-CMs的存活数量,并且大部分移植的i PS-CMs均表达c Tn T。v WF和Lyve-1染色结果表明,NGR1预处理还能提高i PS-CMs移植后的血管密度和淋巴管密度。NGR1预处理的hi PS-CMs移植组中各细胞因子VEGFC、IGF-1、SDF-1的水平明显高于hi PS-CMs移植组和MI组。结论NGR1可以保护MSCs对抗H2O2造成的细胞凋亡,促进IGF-1、VEGF、SCF和b FGF的分泌,其机制可能与PI3K/Akt/Fox O1信号通路有关。NGR1预处理可能通过增强MSCs的存活和旁分泌途径提高MSCs移植治疗MI的作用。通过对GSK3和Wnt信号通路的抑制和控制细胞浓度可以有效诱导i PS分化为hi PS-CMs。NGR1有促进hi PS-CMs增殖的趋势并可提高p-Akt的水平。NGR1预处理能够提高hi PS-CMs移植治疗裸鼠MI的作用,其主要机制可能与增强细胞的存活和旁分泌途径有关。
宋晓龙[7]（2019）在《鹿红方对冠心病心衰患者临床研究及通过旁分泌促乳鼠心肌增殖的实验研究》文中提出目的:1、观察鹿红方对冠心病阳虚血瘀证心衰患者血清VEGF、IGF-1、B NP变化,观察鹿红方对以上患者的临床证候、心功能、运动耐量、生活质量及中医证候积分等的影响,研究鹿红方对冠心病阳虚血瘀心衰患者临床疗效,并初步探讨其机制。2、观察鹿红方对Sca-1+心肌细胞旁分泌以及对心肌细胞内PI3K/Akt通路影响,分析其促进乳鼠心肌细胞增殖的机制,为鹿红方治疗心衰提供理论依据。方法:临床试验:收集符合纳入标准的冠心病阳虚血瘀证心衰患者,对照组治疗参考慢性心衰指南制定方案,治疗组则加用鹿红方。观察治疗前后患者（1）BNP、VEGF、IGF-1水平;（2）心脏彩超:LVEF、LVEDD、LVESD、SV;（3）6min步行试验;（4）MLHFQ评分;（5）NYHA分级变化及疗效;（6）各证候积分、中医证候积分。细胞实验:将实验分为五组,CMs组、CMs+Sca-1组、CMs+Sca-1+LY294002组、CMs+Sca-1+LHF组、CMs+Sca-1+LHF+LY294002组。（1）运用流式细胞仪技术,检测各组24h、48h、72h心肌细胞增殖情况（Ki67+、Brd U+、H3P+）;（2）ELISA检测上清液VEGF、IGF-1、HGF水平;（3）RT-PCR检测PI3K、A KT m RNA的相对量;（4）Western blot检测PI3K、AKT、p-AKT蛋白水平。结果:1、临床试验:（1）鹿红方降低冠心病心衰阳虚血瘀证患者中医证候积分、MLHFQ得分,提高6min步行距离,改善患者NYHA心功能疗效,提高生活质量和运动耐量,疗效优于对照组（P<0.05）;（2）各中医证候中,改善气短气喘、畏寒肢冷、唇甲青紫、疲倦乏力方面优于对照组（P<0.05）;（3）鹿红方可降低BNP、提高VEGF、IGF-1水平,且优于对照组（P<0.05）;（4）鹿红方可降低心超LVEDD、LVESD,提高LVEF、SV水平,其中在改善LVEF、L VESD方面优于对照组（P<0.05）。2、细胞实验:（1）Sca-1+心肌细胞可显着提高乳鼠心肌细胞增殖标志物（Br d U、Ki67、H3P）阳性百分率,鹿红方可加强Sca-1+心肌细胞促乳鼠心肌细胞增殖作用,且在24h时达到顶峰（P<0.05）;（2）鹿红方可增强Sca-1+心肌细胞的旁分泌作用,提高VEGF、IGF-1、HGF水平（P<0.05）;（3）鹿红方可上调乳鼠心肌细胞内PI3K、Akt蛋白水平。结论:1、鹿红方可以显着改善冠心病合并心衰阳虚血瘀证患者的中医证候、增强心脏收缩功能、改善NYHA心功能、提高生活质量、增加运动耐量水平,其机制可能是提高患者VEGF、IGF-1水平,降低BNP水平。2、鹿红方可以增强Sca-1+心肌细胞的旁分泌作用,提高VEGF、IGF-1、HGF水平,激活心肌细胞内PI3K/Akt通路,促进乳鼠心肌细胞的增殖。
朱晓龙[8]（2019）在《骨痿康颗粒对大鼠骨髓干细胞的动员作用及外周血VEGF、TGF-β、PDGF表达量的影响》文中研究说明目的通过观察骨痿康颗粒对大鼠外周血中白细胞计数、单个核细胞计数、CD34+细胞含量及VEGF、TGF-β、PDGF细胞生长因子表达量的影响,探讨骨痿康颗粒对大鼠骨髓干细胞的动员作用以及外周血细胞生长因子的表达影响,为下一步运用中药动员干细胞以及增加外周血细胞生长因子含量来达到无创性的治疗骨缺血坏死、骨缺损、骨不连等骨科疾病做前期的基础研究。方法SD大鼠60只,随机分为4组,每组15只。生理盐水组:生理盐水灌胃,同时皮下注射生理盐水;骨痿康颗粒组:骨痿康颗粒稀释剂灌胃,同时皮下注射生理盐水;粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor,G-CSF）组（G-CSF组）:生理盐水灌胃,同时皮下注射G-CSF;骨痿康颗粒+G-CSF（联合用药组）:骨痿康颗粒稀释剂灌胃,同时皮下注射G-CSF;连续用药5天后,各组取大鼠外周血,检测计数大鼠外周血中白细胞计数和单个核细胞数量,流式细胞仪检测CD34+细胞百分比,ELISA检测外周血VEGF、TGF-β、PDGF含量。结果用药5天后,生理盐水组、骨痿康颗粒组、G-CSF组以及骨痿康颗粒+G-CSF组外周血白细胞计数分别为（7.47±0.40）×109/L、（7.76±0.41）×109/L、（19.81±0.66）×109/L、（20.01±0.58）×109/L,骨痿康颗粒组白细胞计数与生理盐水组比较（P﹥0.01）,G-CSF组白细胞计数与骨痿康颗粒+G-CSF组比较（P﹥0.01）,G-CSF组以及骨痿康颗粒+G-CSF组外周血白细胞计数均高于生理盐水组（P﹤0.01）;生理盐水组、骨痿康颗粒组、G-CSF组以及联合用药组外周血单个核细胞计数分别为（3.32±0.30）×109/L、（4.93±0.51）×109/L、（10.99±0.62）×109/L、（12.64±0.69）×109/L,其中,骨痿康颗粒组单个核细胞计数高于生理盐水组（P﹤0.01）,G-CSF组单个核细胞计数高于骨痿康颗粒组（P﹤0.01）,联合用药组高于G-CSF组（P﹤0.01）;骨痿康颗粒组、G-CSF组以及联合用药组CD34+细胞百分比为（0.78±0.04）%、（3.26±0.07）%、（3.90±0.08）%,均高于生理盐水组的（0.20±0.02）%（P﹤0.01）,其中G-CSF组CD34+细胞百分比高于骨痿康颗粒组（P﹤0.01）,联合用药组CD34+细胞百分比高于G-CSF组（P﹤0.01）。骨痿康颗粒组、G-CSF组和联合用药组的大鼠VEGF、TGF-β含量均高于生理盐水组（P﹤0.01）,其中G-CSF组VEGF、TGF-β含量高于骨痿康颗粒组（P﹤0.01）,联合用药组VEGF、TGF-β含量高于G-CSF组（P﹤0.01）。各组大鼠PDGF含量比较,骨痿康颗粒组和联合用药组PDGF含量高于生理盐水组（P﹤0.01）,但是G-CSF组PDGF含量与生理盐水组比较无差异（P﹥0.01）。结论中药骨痿康颗粒对干细胞具有一定的动员作用,同时能够增加外周血VEGF、TGF-β、PDGF表达量,临床上骨痿康颗粒治疗骨缺血坏死等疾病的细胞学机制可能与此有关。骨痿康颗粒联合G-CSF对干细胞的动员效果最佳,并且能够在动员干细胞的同时,显着增加外周血中VEGF、TGF-β、PDGF含量。这提示我们在今后的研究中,可以更多的尝试将中药作为干细胞动员剂或辅助干细胞动员,在增加外周血干细胞数量的同时增加外周血中细胞生长因子的含量,为受损组织的修复提供充足的干细胞来源和生长因子条件。实验证明利用中药参与干细胞动员治疗骨科疾病在细胞学上具有可行性,具有研究意义。
施盛[9]（2018）在《Shh基因过表达的间充质干细胞在心肌梗死治疗中的疗效探究》文中指出背景:间充质干细胞（MSCs）是一类具有自我更新能力的细胞,在一定的诱导条件下它能够分化为脂肪细胞、成骨细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞类型的多能干细胞,并能分泌多种生长因子诱导血管生成。这使得间充质干细胞在再生医学方面得到了广泛的关注。目前,利用干细胞移植技术治疗缺血性疾病是一个快速发展的领域,其安全性和有效性已经被不同的研究证实。MSCs治疗缺血性心肌病其原理是通过移植或动员干细胞进入缺血性的心肌组织,增加梗死区域心肌样细胞数量及毛细血管数量,逆转心脏重构,进而改善心功能。虽然MSCs向心肌细胞分化能力还存有争议,但MSCs向内皮细胞、平滑肌细胞或血管周细胞的分化能力已得到证实。血管生成能力的增强有助于增加血管数量,从而改善心脏功能。MSCs移植可以通过刺激血管生成来促进心肌的修复,是一种有前景的缺血性心脏病治疗的细胞类型。Hedgehog（Hh）蛋白是一种在胚胎发育过程中具有重要作用的成形素,它们控制着胚胎发育过程中不同的组织和器官的发育模式。VEGF信号通路是调节血管发育和内皮细胞分化的重要信号通路之一,VEGF诱导MSCs向内皮细胞分化的确切调控机制还未明确。Shh与多种血管生成因子相关,能促进VEGF的表达,参与血管的新生,对急性及慢性心肌缺血模型和缺血再灌注损伤模型有明显的治疗作用。Shh可以通过激活血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素促进血管生成,因此Shh可能是血管生成的关键调控分子之一,因此也被认为是增强血管生成较有前景的治疗分子。第一部分过表达Shh基因的大鼠BMSCs的构建目的:从大鼠中分离骨髓间充质干细胞,并利用慢病毒系统构建Shh过表达的MSCs细胞株。方法:首先从幼龄大鼠中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）,取传至第三代的细胞,流式细胞技术对表面相关标记分子进行检测。然后利用PCR扩增技术成功的克隆出了Shh基因,并利用慢病毒系统将Shh基因在BMSCs细胞中稳定过表达。结果:检测结果显示,CD90、CD29抗原在细胞表面高表达,MHC II和CD11b/c在细胞表面不表达,表明我们分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。RT-q PCR检测发现,MSCs中Shh m RNA的表达水平上调,且Shh m RNA表达水平在转染后3天和7天中增加了约3000倍和5000倍。结论:成功的从大鼠骨髓中分离出间充质干细胞,并成功的构建过表达Shh基因的MSCs细胞株。第二部分Shh基因促进BMSCs向内皮细胞分化能力的研究目的:体外实验验证过表达Shh基因后,对于MSC向内皮细胞分化的影响。方法:利用RT-q PCR分别检测Shh转染3天和7天后MSCs细胞中,促血管生成分子Ptch1、IGF1、HGF、Ang-1以及VEGF-A的表达水平,并在分别使用管样形成实验、Transwell迁移实验和体内胶栓实验,检测了MSCShh管样形成能力、细胞的迁移能力和向内皮细胞分化的能力。结果:过表达Shh后,MSCs细胞中促血管生成分子表达水平上调,MSCShh的管样形成能力、迁移能力和向内皮细胞分化的能力显着高于MSCNC对照组。而且转染后7天的MSCShh细胞的成管长度和节点数量以及向内皮细胞分化能力明显高于转染后3天的细胞。结论:过表达Shh基因后,MSCs中促血管生成生长因子的表达增加,体外迁移能力、成管能力增强以及血管新生的能力增强。第三部分过表达Shh基因的BMSCs治疗大鼠心肌梗死的疗效探究目的:大鼠心梗模型中验证过表达Shh基因后,MSC对心梗的修复效果。方法:将Shh过表达前后的MSC细胞,移植到大鼠心梗模型中。心超检测心功能的恢复情况,Masson染色观察纤维化心梗后的纤维化面积。结果:MSCNC以及MSCShh均能够修复心梗后的心功能,且向较于MSCNC组,MSCShh组的修复效果更加明显。结论:过表达Shh基因后,MSC细胞能更有效地减少梗死区域面积,改善心功能。第四部分Shh基因促进BMSCs的内皮细胞分化能力的机制探讨目的:进一步的研究探讨,过表达Shh基因的MSCs细胞向内皮分化的具体机制。方法:将MSCNC和MSCShh的进行高通量测序,并对测序结果进行初步分析,找出差异表达的基因,筛选靶基因。利用si RNA技术,将靶基因沉默后分别验证MSCNC细胞的成管能力和心梗修复的能力。结果:结果发现MSCShh中,VEGF-D等与血管生成相关的基因的表达远高于在MSCNC中的表达。特别是在过表达Shh后VEGF-D的表达水平明显上调,提示Shh分子可能通过促进VEGF-D的表达进而促进血管新生。并进一步分别在细胞水平和动物水平上对此进行验证。用si RNA抑制VEGF-D的表达后,MSCShh的成管能力下降,体内实验发现其心梗后的修复效果受到抑制。结论:Shh基因可以通过Shh/VEGF-D信号轴促进骨髓间充质干细胞的向内皮分化。
李鑫辉,黄政德,黄淼鑫,杜建芳,李雅婧,许福丽,肖青,郭晨鹤,徐玛丽[10]（2018）在《益气活血方动员骨髓干细胞对心肌缺血再灌注损伤大鼠JAK2-PI3K信号转导调节的动态影响》文中进行了进一步梳理目的探讨益气活血方动员骨髓干细胞对心肌缺血再灌注损伤（IRI）大鼠JAK2-PI3K信号转导调节的动态影响。方法大鼠144只随机为A:假手术组;B:IRI组;C:rh EPO动员组;D:益气活血方组;E:益气活血方联合动员组,F:LY294002组（益气活血方联合动员+PI3K的特异性阻断剂组）,每组8只,于造模后3个不同时间段观察心肌细胞JAK2-PI3K信号途径蛋白表达及凋亡情况,结果 IRI组心肌细胞JAK2、PI3K蛋白表达均降低而凋亡指数升高,而其余各组凋亡指数降低,JAK2、PI3K蛋白表达增加,且随着时间推移逐渐明显;当使用PI3K阻断剂后,保护作用消失。结论益气活血方动员骨髓干细胞治疗心肌IRI,降低大鼠心肌细胞凋亡指数,其机制可能与调节JAK2-PI3K信号途径相关。
二、动员的骨髓干细胞保护大鼠缺血心肌机制的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、动员的骨髓干细胞保护大鼠缺血心肌机制的研究（论文提纲范文）
（1）益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 益气活血方联合骨髓间充质干细胞对大鼠心肌梗死心功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 实验二 益气活血方对骨髓间充质干细胞缺血心肌归巢影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 实验三:益气活血方联合骨髓间充质干细胞通过miRNA-210/BNIP3 通路影响自噬-凋亡机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 microRNA在心肌梗死后心室重构中的研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药治疗心肌梗死后心室重构的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 针刺治疗心肌缺血及相关分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（3）骨髓干细胞动员抑制TGF-β非经典通路对抗大鼠心肌纤维化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第二章 资料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 Iso诱导大鼠心肌纤维化改变 |
| 3.2 外周血粒细胞的检测和鉴定 |
| 3.3 G-CSF动员改善心肌纤维化大鼠的心功能 |
| 3.4 G-CSF动员后大鼠心肌病理形态分析 |
| 3.5 心肌免疫组化检测Ⅲ型胶原纤维 |
| 3.6 心肌Ⅰ型胶原纤维蛋白表达 |
| 3.7 G-CSF动员对TGF-β/TAK1/MKK3/p38MAPK通路蛋白的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）降香新黄酮latifolin促进骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病心肌修复作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞提取、培养和鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验仪器与材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 相关溶液的配制 |
| 2.2 BM-MSCs提取、培养和传代 |
| 2.3 BM-MSCs鉴定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 BM-MSCs形态观察 |
| 3.2 BM-MSCs表面抗原标志物鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 latifolin通过改变炎性微环境对骨髓间充质干细胞的保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 受试药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验仪器与材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 相关溶液的配制 |
| 2.2 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs生存率影响 |
| 2.3 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs凋亡的影响 |
| 2.4 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性因子分泌影响 |
| 2.5 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性基因表达影响 |
| 2.6 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs活力的影响 |
| 2.7 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs凋亡的影响 |
| 2.8 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs炎性因子分泌影响…. |
| 2.9 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs形态的影响 |
| 3.2 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs活力的影响 |
| 3.3 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs凋亡的影响 |
| 3.4 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎症因子基因表达的影响 |
| 3.5 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性因子分泌的影响 |
| 3.6 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs中 NF-κB的影响 |
| 3.7 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs活力的影响 |
| 3.8 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs凋亡影响 |
| 3.9 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs炎性因子分泌的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 latifolin促进骨髓间充质干细胞定向心肌分化作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 受试药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验仪器与材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 相关溶液的配制 |
| 2.2 实验分组和诱导分化 |
| 2.3 倒置显微镜观察分化细胞形态 |
| 2.4 RT-PCR测定分化细胞心肌特异性基因表达 |
| 2.5 免疫荧光法检测分化细胞心肌特异性蛋白表达 |
| 2.6 透射电镜观察分化细胞结构 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 倒置显微镜观察分化细胞形态 |
| 3.2 RT-PCR测定分化细胞心肌特异性基因表达 |
| 3.3 免疫荧光法检测分化细胞心肌特异性蛋白表达 |
| 3.4 透射电镜观察分化细胞结构 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四部分 latifolin促进骨髓间充质干细胞修复受损心肌作用及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 受试细胞 |
| 1.3 受试药物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 实验仪器与材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 相关溶液的配制 |
| 2.2 latifolin促进BM-MSCs修复受损心肌细胞的作用 |
| 2.2.1 H9c2 细胞培养 |
| 2.2.2 BM-MSCs与 H9c2 细胞共培养体系建立 |
| 2.2.3 细胞处理和实验分组 |
| 2.2.4 Annexin V/PI法测定共培养条件下H9c2 细胞凋亡 |
| 2.3 latifolin促进BM-MSCs移植治疗心肌梗死作用及机制研究 |
| 2.3.1 实验分组和给药 |
| 2.3.2 BM-MSCs标记 |
| 2.3.3 心肌梗死模型建立 |
| 2.3.4 BM-MSCs移植 |
| 2.3.5 大鼠血清中心肌损伤标志物检测 |
| 2.3.6 超声心动图评价大鼠心功能 |
| 2.3.7 TTC染色检测大鼠心脏梗死面积 |
| 2.3.8 HE染色评价大鼠心肌病理损伤情况 |
| 2.3.9 Masson染色评价大鼠心肌胶原纤维化情况 |
| 2.3.10 免疫荧光检测BM-MSCs生存率和心肌分化情况 |
| 2.3.11 免疫组织化学检测组织中炎性细胞情况 |
| 2.3.12 WB检测组织中炎症和分化通路相关蛋白表达情况 |
| 2.4 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 latifolin促进BM-MSCs修复受损心肌细胞的作用 |
| 3.1.1 Annexin V/PI法测定共培养条件下H9c2 细胞凋亡 |
| 3.2 latifolin促进BM-MSCs移植治疗心肌梗死作用及机制研究 |
| 3.2.1 MI心电图监测 |
| 3.2.2 BM-MSCs标记CM-Dil |
| 3.2.3 实验大鼠死亡情况 |
| 3.2.4 大鼠血清中LDH、CK-MB含量 |
| 3.2.5 超声心动图评价大鼠心功能 |
| 3.2.6 TTC染色评价大鼠心脏面积 |
| 3.2.7 HE染色评价心肌损伤和炎性细胞情况 |
| 3.2.8 Masson染色评价心肌胶原纤维化情况 |
| 3.2.9 免疫荧光检测BM-MSCs生存率和心肌分化情况 |
| 3.2.10 免疫组织化学检测组织中炎性细胞情况 |
| 3.2.11 WB检测组织中炎症和分化通路相关蛋白表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新点 |
| 本研究的不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
（5）淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 一、补肾中药调控干细胞的相关研究 |
| 1. 淫羊藿对干细胞的调控 |
| 2. 其他补肾中药对干细胞的调控 |
| 二、HGF在干细胞领域的研究进展 |
| 1. HGF的概述 |
| 2. HGF对干细胞的影响 |
| 三、线粒体自噬的研究进展 |
| 1. 线粒体自噬的概述 |
| 2. 中药调控线粒体自噬 |
| 第二部分 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路增强人脐带间充质干细胞抗凋亡能力的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 1. 实验细胞 |
| 2. 实验仪器 |
| 3. 实验试剂与耗材 |
| 4. 主要试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. MTS法测细胞活力 |
| 3. CCK8法测细胞活力 |
| 4. BrdU掺入试验测细胞增殖率 |
| 5. 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 6. western blot(化学)方法检测蛋白表达 |
| 7. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 8. 质粒提取与细胞转染 |
| 9. ELISA法测蛋白表达 |
| 10. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 淫羊藿素促进人脐带间充质干细胞的细胞活力与增殖活性 |
| 2. HGF/c-Met通路在人脐带间充质干细胞中具有抗凋亡作用 |
| 3. 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路抑制人脐带间充质干细胞凋亡 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞线粒体自噬的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 1. MTS法测细胞活力 |
| 2. western blot(荧光)方法检测蛋白表达 |
| 3. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 4. MitoTracker与目标蛋白共标记进行免疫荧光显微镜检测 |
| 5. 线粒体膜电位检测(JC-1) |
| 6. 电镜检测 |
| 7. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 自噬抑制剂3-MA对无血清培养人脐带间充质干细胞的影响 |
| 2. 淫羊藿素增加无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体蛋白 |
| 3. 淫羊藿素抑制无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体自噬 |
| 4. 淫羊藿素提高无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体膜电位 |
| 四、讨论 |
| 第四部分 淫羊藿素预处理人脐带间充质干细胞蛋白质组学分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 蛋白浓度测定结果 |
| 2. 差异蛋白筛选结果 |
| 3. 生物信息学分析 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）三七皂苷R1预处理提高干细胞移植治疗心肌梗死的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 研究背景 |
| 研究意义和价值 |
| 英文缩略词表 |
| 技术路线 |
| 第一部分 NGR1预处理对MSCs存活和移植治疗心肌梗死的影响及机制 |
| 1 实验动物 |
| 2 主要器械 |
| 3 主要药品及试剂 |
| 4 主要耗材 |
| 5 实验设计 |
| 5.1 MSCs培养 |
| 5.2 MSCs复苏 |
| 5.3 MSCs传代 |
| 5.4 CCK8检测NGR1对细胞活力的影响 |
| 5.5 TUNEL检测 |
| 5.6 ROS检测 |
| 5.7 WB检测p-Akt、p-FoxO1的表达 |
| 5.8 ELISA检测细胞培养液中IGF-1、VEGF、SCF、bFGF含量 |
| 5.9 MSCs外泌体提取 |
| 5.10 MSCs转录组基因测序 |
| 5.11 模型制备及细胞移植 |
| 5.12 心功能检测 |
| 5.13 组织取材 |
| 5.14 冰冻切片制备 |
| 5.15 Masson三色染色 |
| 5.16 免疫荧光染色 |
| 5.17 统计学方法 |
| 6 结果 |
| 6.1 NGR1对抗H2O2诱导的MSCs凋亡 |
| 6.2 NGR1对PI3K/Akt/FoxO1和CREB信号通路的影响 |
| 6.3 NGR1通过PI3K/Akt/FoxO1信号通路保护MSCs |
| 6.4 NGR1通过PI3K/Akt/FoxO1信号抑制细胞内ROS水平 |
| 6.5 NGR1对细胞因子分泌的影响 |
| 6.6 NGR1预处理提高MSC外泌体中miR-21的表达 |
| 6.7 NGR1对MSC转录组基因表达的影响 |
| 6.8 NGR1预处理的MSCs移植改善心功能 |
| 6.9 NGR1预处理的MSCs移植降低梗死面积和胶原沉积 |
| 6.10 NGR1预处理的MSCs移植提高MSCs存活和降低心肌组织细胞凋亡 |
| 6.11 NGR1预处理的MSCs移植促进血管新生和旁分泌 |
| 7 小结 |
| 第二部分 NGR1预处理提高hiPS-CMs移植治疗心梗 |
| 1 实验动物 |
| 2 主要器械 |
| 3 主要药品及试剂 |
| 4 主要耗材 |
| 5 实验设计 |
| 5.1 hiPSs复苏 |
| 5.2 hiPSs传代 |
| 5.3 hiPSs诱导分化及心肌细胞标志物的检测 |
| 5.4 CCK8检测NGR1对hiPS-CMs增殖的作用 |
| 5.5 WB检测p-Akt的表达 |
| 5.6 模型制备及细胞移植 |
| 5.7 心功能检测 |
| 5.8 组织取材 |
| 5.9 冰冻切片制备 |
| 5.10 Masson三色染色 |
| 5.11 免疫荧光染色 |
| 5.12 qRT-PCR检测 |
| 5.13 统计学方法 |
| 6 结果 |
| 6.1 hiPSs诱导分化及心肌细胞标志物的检测 |
| 6.2 NGR1对hiPS-CMs增殖的影响 |
| 6.3 NGR1对hiPS-CMs PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 6.4 NGR1预处理的hiPS-CMs移植改善心功能 |
| 6.5 NGR1预处理的hiPS-CMs移植降低梗死面积和胶原沉积 |
| 6.6 NGR1预处理的hiPS-CMs移植提高移植细胞存活,降低心脏组织凋亡 |
| 6.7 NGR1预处理的hiPS-CMs移植促进血管新生 |
| 6.8 NGR1预处理的hiPS-CMs移植促进淋巴管新生 |
| 6.9 NGR1预处理的hiPS-CMs移植促进旁分泌 |
| 7 小结 |
| 讨论 |
| 1、选择合适的细胞类型是干细胞移植的首要问题 |
| 2、NGR1预处理是一种用于提高干细胞移植后存活的可行手段 |
| 3、Pi3k/Akt/FoxO1信号通路参与NGR1促进干细胞存活 |
| 4、NGR1通过旁分泌机制促进干细胞移植治疗MI |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 文献综述 间充质干细胞来源的外泌体治疗心肌梗死的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 |
| 附录三 硕士研究生期间撰写和已发表论文 |
| 附录四 |
| 研究生期间参加活动及会议 |
| 研究生期间参与研究课题 |
（7）鹿红方对冠心病心衰患者临床研究及通过旁分泌促乳鼠心肌增殖的实验研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 鹿红方对冠心病合并心衰阳虚血瘀证患者的临床研究 |
| 1 临床资料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳排、中止、脱落、剔除标准 |
| 2 实施方案 |
| 2.1 试验药物 |
| 2.2 药物分配 |
| 3 总体设计与治疗方案 |
| 3.1 总体设计 |
| 3.2 研究病例样本量与安排 |
| 3.3 随机分组方法 |
| 3.4 病例纳入 |
| 3.5 用药方法 |
| 3.6 试验周期 |
| 4 观察指标 |
| 4.1 一般资料 |
| 4.2 安全性指标 |
| 4.3 效应性指标 |
| 5 统计方法 |
| 5.1 统计描述 |
| 5.2 统计推断方法 |
| 5.3 统计工具 |
| 6 技术路线图 |
| 7 结果 |
| 7.1 两组基线情况 |
| 7.2 两组BNP比较 |
| 7.3 两组IGF-1比较 |
| 7.4 两组VEGF比较 |
| 7.5 两组心脏彩超各参数分析 |
| 7.6 两组6-min步行试验比较 |
| 7.7 两组MLHFQ评分比较 |
| 7.8 两组治疗前后NYHA心功能比较 |
| 7.9 两组治疗前后NYHA心功能的疗效比较 |
| 7.10 两组治疗前后中医证候总积分比较 |
| 7.11 两组治疗前后中医各证候积分比较 |
| 8 讨论 |
| 8.1 中医学对心力衰竭的认识 |
| 8.2 西医学对心力衰竭的认识 |
| 8.3 鹿红方在冠心病心衰阳虚血瘀证治疗中临床疗效及机理探讨 |
| 8.4 结论 |
| 第二部分 鹿红方调控Sca-1~+细胞旁分泌促进乳鼠心肌增殖实验研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 鹿红方干预浓度的确定 |
| 2.3 乳鼠心肌细胞分离和培养 |
| 2.4 Sca-1~+细胞分离、培养及鉴定 |
| 2.5 Transwell共培养 |
| 2.6 流式检测乳鼠心肌增殖情况 |
| 2.7 细胞因子检测 |
| 2.8 RT-PCR检测PI3K、AKT mRNA的相对量 |
| 2.9 Western blot检测PI3K、AKT、p-AKT蛋白水平 |
| 2.10 统计分析 |
| 2.11 技术路线图 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 流式细胞仪检测BrdU~+百分率 |
| 3.2 流式细胞仪检测Ki67~+百分率 |
| 3.3 流式细胞仪检测H3P~+百分率 |
| 3.4 ELISA检测24h上清液IGF-1、HGF、VEGF水平 |
| 3.5 RT-PCR各组24h PI3K、AKT mRNA 的相对表达量 |
| 3.6 Western Blot检测各组24H PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞疗法治疗心衰 |
| 4.2 PI3K/Akt通路在细胞疗法治疗心衰中研究进展 |
| 4.3 中医药在细胞疗法治疗心衰研究进展 |
| 4.4 鹿红方促进Sca-1~+心肌细胞旁分泌,增强乳鼠心肌细胞增殖的机理探讨 |
| 4.5 结论 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 文献综述 |
| References |
| 附录2 在校期间发表学术论文 |
| 附录3 参加学术会议情况 |
（8）骨痿康颗粒对大鼠骨髓干细胞的动员作用及外周血VEGF、TGF-β、PDGF表达量的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要实验设备 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 实验要药品 |
| 1.4 实验动物 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物给药 |
| 2.2 实验分组 |
| 2.3 观察指标 |
| 2.4 实验步骤 |
| 2.5 统计方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 大鼠外周血白细胞(WBC)、单个核细胞(MNC)计数 |
| 3.2 大鼠CD34~+细胞占单个核细胞百分比 |
| 3.3 大鼠外周血VEGF、TGF-β、PDGF细胞生长因子表达量 |
| 4.讨论 |
| 4.1 骨髓干细胞及干细胞动员的概念 |
| 4.2 中医对干细胞及干细胞动员的认识与作用 |
| 4.3 中医对VEGF、TGF-β、PDGF细胞生长因子的认识与作用 |
| 4.4 本次实验研究的意义 |
| 4.5 骨髓干细胞动员在骨科疾病中的应用 |
| 5.存在的问题与展望 |
| 5.1 本课题的不足之处 |
| 5.2 未来中药参与干细胞动员的研究展望 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）Shh基因过表达的间充质干细胞在心肌梗死治疗中的疗效探究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 过表达Shh基因的大鼠BMSCs的构建 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 Shh基因促进BMSCs向内皮细胞分化能力的研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 过表达Shh基因的BMSCs治疗大鼠心肌梗死的疗效探究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四部分 Shh基因促进BMSCs的内皮细胞分化能力的机制探讨 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 Shh信号通路在临床的潜在应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 间充质干细胞在心肌再生中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（10）益气活血方动员骨髓干细胞对心肌缺血再灌注损伤大鼠JAK2-PI3K信号转导调节的动态影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物、主要试剂及仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 造模方法 |
| 1.2.2 动物分组及给药方法 |
| 1.2.3 心肌细胞JAK2、PI3K蛋白表达测定 |
| 1.2.4 心肌细胞凋亡检测 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 益气活血方动员骨髓干细胞对心肌IRI大鼠心肌细胞JAK2蛋白表达的影响 |
| 2.2 益气活血方动员骨髓干细胞对心肌IRI大鼠心肌细胞PI3K蛋白表达的影响 |
| 2.3 益气活血方动员骨髓干细胞对心肌IRI大鼠心肌细胞凋亡的影响 |
| 3 讨论 |
四、动员的骨髓干细胞保护大鼠缺血心肌机制的研究（论文参考文献）
- [1]益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究[D]. 冀楠. 天津中医药大学, 2021(01)
- [2]针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究[D]. 李记泉. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [3]骨髓干细胞动员抑制TGF-β非经典通路对抗大鼠心肌纤维化的研究[D]. 夏文庆. 南方医科大学, 2020(01)
- [4]降香新黄酮latifolin促进骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病心肌修复作用及机制研究[D]. 张妮. 江西中医药大学, 2019(06)
- [5]淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究[D]. 王璐. 广州中医药大学, 2019(08)
- [6]三七皂苷R1预处理提高干细胞移植治疗心肌梗死的作用及其机制[D]. 蔡昊. 上海中医药大学, 2019
- [7]鹿红方对冠心病心衰患者临床研究及通过旁分泌促乳鼠心肌增殖的实验研究[D]. 宋晓龙. 上海中医药大学, 2019(03)
- [8]骨痿康颗粒对大鼠骨髓干细胞的动员作用及外周血VEGF、TGF-β、PDGF表达量的影响[D]. 朱晓龙. 安徽中医药大学, 2019(02)
- [9]Shh基因过表达的间充质干细胞在心肌梗死治疗中的疗效探究[D]. 施盛. 苏州大学, 2018(06)
- [10]益气活血方动员骨髓干细胞对心肌缺血再灌注损伤大鼠JAK2-PI3K信号转导调节的动态影响[J]. 李鑫辉,黄政德,黄淼鑫,杜建芳,李雅婧,许福丽,肖青,郭晨鹤,徐玛丽. 中国老年学杂志, 2018(15)