一、肾小管上皮细胞与基底膜的粘附力学特性（论文文献综述）
高小民[1]（2021）在《EZH2抑制剂3-DZNeP在草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用和机制研究》文中研究说明研究目的:肾结石发病率和复发率高,而且目前为止有关肾结石发病机制一直不是很明确,因此在临床上该疾病是长期困扰泌尿外科医师的难题。尿液中草酸浓度的升高是诱导肾结石形成的高危因素之一,因此本次课题采用高草酸尿模型。我们课题组前期成功在小鼠上构建了肾结石模型,使用基因芯片技术比对对照组和模型组之间不同基因的表达水平。其中近来研究较多的一个表观遗传分子EZH2在模型组中表达明显升高。通过回顾相关文献,我们发现在多种肾损伤模型中,使用3-DZNe P靶向抑制EZH2的表达均能明显减轻肾脏损伤,改善肾功能。因此,本次研究主要目的是探求使用3-DZNe P能否逆转高草酸刺激环境下诱导的肾损伤,以期为肾结石的发病以及复发提供相关治疗思路。研究方法:通过免疫组化,蛋白免疫印迹,CCK-8实验,乳酸脱氢酶细胞毒性检测,活性氧检测等方法测试高草酸刺激下肾小管上皮细胞的损伤程度以及3-DZNe P在其中发挥的作用。机制探索方面,我们回顾性检索相关文献报道,筛选3-DZNe P作用的,与细胞增殖密切相关的经典通路,并采用通路抑制剂以及小干扰RNA（si RNA）敲减相关基因表达等方式探索上游转录因子对于下游目的基因转录的调控作用。研究结果:（一）EZH2抑制剂3-DZNe P能减轻高草酸尿症大鼠模型诱导的肾损伤及减少结石形成首先,我们发现相比对照组,模型组中肾小管损伤明显加重,肾功能明显受损,肾结晶明显形成;模型组中EZH2和H3K27me3的蛋白表达水平也明显升高,并且造模第4周比第2周的表达更高。PCR和免疫组化结果也表明EZH2在模型组中高表达,并且EZH2主要在肾小管上皮细胞的细胞核中表达。其次,我们使用EZH2抑制剂3-DZNe P抑制EZH2高表达后发现cleaved-caspase3,IL-6和MCP-1表达水平明显下调,这表明3-DZNe P明显减轻了高草酸尿症模型组中肾小管损伤,减少了肾结晶的形成,改善了肾功能。（二）EZH2抑制剂3-DZNe P能减轻草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤首先,CCK-8、LDH释放实验和ROS检测实验发现不同浓度的草酸和不同时长刺激肾小管上皮细胞NRK-52E均会降低细胞的活力,增加细胞内的活性氧ROS。其次,我们发现随着刺激浓度的升高和刺激时间延长,细胞内的凋亡指标cleaved-caspase3和炎症指标IL-6和MCP-1表达逐渐增高,这表明草酸会促使NRK-52E细胞凋亡和炎症反应增加。TUNEL实验也证实高草酸刺激会诱导细胞凋亡。然而草酸的刺激并没有导致NRK-52E细胞内EZH2高表达,但是其修饰作用的H3K27me3随着草酸刺激的浓度和时间的增加逐渐表达上调,这说明了NRK-52E在草酸刺激下EZH2虽然表达水平不发生改变,但是活性逐渐增强。最后,我们使用3-DZNe P预处理NRK-52E细胞后再用草酸刺激发现,相比单纯草酸刺激组,加药组EZH2表达显着下调,随之cleaved-caspase3,IL-6和MCP-1也表达明显下降。TUNEL实验也发现3-DZNe P组细胞凋亡明显减少。CCK-8、LDH释放实验和ROS检测实验也证实3-DZNe P组细胞活力明显恢复,细胞内氧化应激水平显着减轻。随后我们使用Sh RNA敲减EZH2后发现,同样在高草酸刺激下,Sh-EZH2组内细胞比Sh-NC组cleaved-caspase3,IL-6和MCP-1蛋白表达水平更低,氧化应激水平更低,凋亡细胞更少。（三）EZH2抑制剂3-DNZe P通过抑制JNK/Fox O3a通路来减轻草酸诱导的肾损伤首先在体外实验中,通过蛋白电泳我们发现草酸刺激能激活MAPK（ERK,JNK和P38）通路,并且能导致Fox O3a蛋白表达升高。使用3-DZNe P能抑制ERK,JNK,P38磷酸化和Fox O3a表达升高,而敲减EZH2之后Fox O3a表达也明显下调了。随后我们在3-DZNe P预处理和草酸刺激基础上设置组别各加入了CC90003,SP600125,SB203580通路抑制剂分别阻断ERK,JNK和P38通路后发现,仅有SP600125能显着降低Fox O3a表达。最后我们用si RNA敲减Fox O3a发现能减轻细胞凋亡。其次体内实验同样发现模型组中p-ERK,p-JNK,p-P38还有Fox O3a表达相比对照组显着上调,而3-DZNe P能逆转该现象。结论:在草酸诱导的肾损伤环境中,使用3-DZNe P能明显减轻细胞凋亡,下调氧化应激水平,从而减少肾结晶。3-DZNe P有可能是通过下调EZH2后抑制JNK磷酸化并随后下调Fox O3a表达来发挥作用的,JNK/Fox O3a可能是介导3-DZNe P减轻高草酸诱导的肾损伤的信号通路。因此使用3-DZNe P靶向EZH2有望未来成为治疗和预防肾结石疾病的潜在治疗策略。
杜鹃[2]（2021）在《CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究》文中认为1 研究背景急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）是以肾滤过功能快速丧失为特点的临床综合征,表现为尿素氮、肌酐等代谢产物的蓄积和/或尿量的减少,其病理特点主要为急性肾小管坏死。研究发现住院患者的发生率约为2-21%,其在社区医院发病率约为2%,而在大型医院发病率可达20%,重症监护病房（Intensive care unit,ICU）的发病率可达50%以上。AKI导致死亡率增加,住院时间延长,以及慢性肾病（Chronic kidney disease,CKD）的发病率增加。总之,AKI给公共卫生及社会资源带来巨大的压力,成为严重的健康问题。传统与新发现的肾病生物学标志物,如血尿素氮、血肌酐、尿NGAL、KIM-1及TIMP2-IGFBP7乘积等,可协助进行AKI的预测和诊断。但它们都仅仅指向预测肾功能降低或肾损伤的发生,缺乏预测肾功能恢复的能力。患者肾损伤的持续时间及肾功能转归可显着影响患者远期预后,因此,早期预测、识别患者的恢复表型,及早干预,促进肾功能早期恢复、改变恢复表型,或能显着改善AKI患者的预后。在预测肾功能恢复的生物学标志物方面,存在较大空白。目前临床亟需理想的生物标志物预测AKI肾功能的转归。外泌体是由细胞分泌的直径为30-150nm的微小囊泡,其中包含完整的膜蛋白（尤其是糖蛋白）、外周膜蛋白、胞质、核蛋白以及细胞内组分,如miRNA,mRNA和代谢产物。同时外泌体通过受体与配体的相互作用,与靶细胞膜的附着/融合或被受体细胞内化,来进行细胞间通讯以及蛋白质和核酸的细胞间交换,从而发挥细胞间信使的作用,参与增殖、凋亡、免疫、凝血等多种生理及病理过程。尿液外泌体主要起源于肾单位管腔和泌尿道内衬的细胞,循环外泌体难以穿过肾小球滤过膜。多项研究发现,尿液外泌体RNA,miRNA和蛋白质可以较尿液其他生化成分更早的反映肾脏疾病中基因表达的变化。尿液外泌体有望成为一种有效且非侵入性的肾脏疾病生物标记物。同时,临床前研究提示外源性外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进修复,提示外泌体可能直接参与肾脏损伤与修复过程。因此,较其他尿液中的分子,外泌体更及时、更直接地体现肾脏细胞的病理生理状态,在预测预后方面更具有优势。CD26,又称为二肽基肽酶 Ⅳ（Dipeptidyl-peptidase 4,DPP4）,是广泛表达于多种细胞表面的一种糖蛋白,可以裂解多种底物的N端二肽基,包括神经肽、肽激素、血管活性肽、趋化因子以及一些生长因子和细胞因子。另外CD26是多功能蛋白,除蛋白水解作用外,以多种方式发挥多种促增殖、免疫和炎症调节等作用。但CD26在AKI中的作用仍待阐明。最近的一项蛋白组学研究发现,与其他尿液及血清蛋白相比,尿CD26在AKI后发生显着变化,推荐尿CD26,尤其尿细胞外囊泡的CD26,为AKI候选生物标志物,值得进一步研究。多项尿液外泌体的组学研究也发现尿液外泌体富含CD26,主要由CD26表达极为丰富的远端肾小管上皮细胞及其他肾脏细胞所释放。尿液中外泌体结合CD26较尿液游离CD26更具有肾脏特异性,且已证实与外泌体结合是尿CD26的主要存在形式,因此,尿外泌体CD26可能对肾功能转归的预测更具有优势。综上,与AKI的早期预测相比,预测肾功能转归的生物标志物仍有较大空白,为临床所亟需。尿外泌体有可能成为新的肾损伤、肾功能转归预测的生物标志物,尿外泌体CD26能否作为AKI的预后标志物有待进一步研究。2目的（1）比较重症AKI患者与重症非AKI患者之间尿外泌体CD26水平的变化,探索尿外泌体CD26是否与AKI相关;（2）探讨尿外泌体CD26是否与AKI分期相关;（3）探讨尿外泌体CD26是否与90天内主要肾脏不良事件相关;（4）（4）探讨尿外泌体CD26是否与AKI肾功能恢复相关;（5）探讨尿外泌体CD26对AKI肾脏功能恢复的预测价值。3方法3.1研究设计该研究为单中心前瞻队列观察性研究。我们同时也收取了入住ICU的非AKI患者作为对照,首先比较两组间尿外泌体CD26表达的差异,以探讨尿外泌体CD26表达与AKI发生是否相关,并通过多元线性回归分析各临床因素对尿外泌体CD26表达有无影响。在AKI患者中按CD26+尿外泌体比率分为CD26高表达和低表达组,首先通过双向比较研究尿外泌体CD26与AKI分期、住院死亡率的关系,继而用生存分析的方法比较尿外泌体CD26表达的高/低与90天内主要肾脏不良事件（MAKE）的关系。其中MAKE包含3个成分,即死亡、接受肾脏替代治疗及肾功能持续恶化,对3个终点和组合终点分别进行分析及检验。应用同样的方法分析尿外泌体CD26表达水平与28天内肾功能恢复的关系,并进一步应用Cox回归分析进行多因素分析;进而在AKI存活者中对3个肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复）进行分析,通过单因素和多因素分析验证尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复和院内肾功能恢复之间的关系。最后,在AKI存活者中检验尿外泌体CD26对早期肾功能恢复,出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测价值,并进行亚组分析。3.2研究对象研究连续纳入2017年1月至2018年1月入住山东大学齐鲁医院ICU,符合AKI诊断的成年患者,构成研究队列。AKI的诊断按照2012 KIDIGO指南推荐的诊断标准。排除标准为:（1）无尿;（2）严重的尿路感染;（3）泌尿系结石或肿瘤;（4）既往应用CD26/DPP4抑制剂;（5）患者或法定代表人拒绝。对照组的患者通过连续筛查2017年1月-2017年3月入住ICU的不符合AKI诊断标准的成年重症患者。排除标准同AKI组。入选患者均按照2012 KIDIGO指南的推荐进行治疗。3.3临床资料的采集采集患者的一般情况,包括:性别,年龄,身高、体重;采集患者的慢性病史及急性合并症;采集患者用药史;生命体征;采集入住ICU 24h内的Scr、尿量,及血常规、血生化、肝功能等数值。计算入住ICU第一天的APACHEII评分及非肾脏APACHE II。3.4临床终点的定义及随访本研究定义的主要终点是90天主要肾脏不良事件（MAKE）,包含:死亡、接受肾脏替代治疗（RRT）和持续肾功能恶化（较入组时肌酐≥200%）。次要终点为肾功能恢复。肾功能恢复的定义为不再符合AKI和CKD的任何一条诊断标准。肾功能恢复终点包含:早期肾功能恢复（7天内）,出院肾功能恢复（出院时处于肾功能恢复状态）和院内肾功能恢复（住院期间发生过肾功能恢复）。随访患者至90天,随访其存活与否,有无接受肾脏替代治疗（RRT）及肌酐数值等。若发生以上事件,记录事件发生的时间,以进行分析。3.5标本采集及保存入组患者在入住ICU的24小时内留取新鲜尿液15ml。常温下,以300g转速离心10min,弃沉渣,取上清,放入-80℃冰箱备用。3.6外泌体分离纯化通过差速超速离心法对尿液标本中的外泌体进行分离和纯化。3.7电镜观察外泌体显微结构样品前处理后,透射电镜观察AKI患者尿液外泌体的超微表征。3.8检测外泌体特征性蛋白利用Western blot及流式细胞术检测外泌体特征性蛋白。3.9乳胶微球辅助的流式细胞术检测尿液外泌体中CD26醛/硫酸盐乳胶微球吸附分离提纯的尿液外泌体,荧光素标记的流式抗体孵育结合的乳胶微球,流式细胞仪检测CD26阳性的尿液外泌体的阳性率。3.10统计学方法对采集的临床资料及检验数据,连续变量用中位数及四分位间距描述,分类变量的描述为病例数（n）和百分比（%）。对于连续变量,采用Student’s t-test检验用于呈正态分布的数据比较,Mann-Whitney检验和Kolmogorov-Smirnov检验用于呈非正态分布的数据比较。对于分类变量,用Pearson’s chi-squared检验进行数据间的比较。首先对AKI组和对照组间进行CD26+尿外泌体比率进行比较,探讨在AKI发生时尿外泌体CD26表达是否发生改变。进而纳入所有患者,以CD26+尿外泌体比率为因变量,纳入临床因素为自变量,进行相关及多元线性回归分析,来除外各临床因素对尿外泌体CD26表达的影响。为研究尿外泌体CD26与90天内MAKE及28天内肾功能恢复间的关系,我们应用类似生存分析KM曲线的方法,并对28天内肾功能恢复应用Cox进行多元回归分析,探讨其独立影响因素。在AKI存活者中进行双向比较,按临床终点分类（早期肾功能恢复/早期肾功能未恢复,出院肾功能恢复/出院肾功能未恢复,院内肾功能恢复/无院内肾功能恢复）,比较两个结局间CD26+尿外泌体比率;分别应用单因素和多因素的方法研究尿外泌体CD26与三个AKI肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复、院内肾功能恢复）的关系。单因素分析将尿外泌体CD26表达水平与三个肾功能恢复终点分别进行单因素chi-squared检验,多因素分析分别以三个肾功能恢复终点为因变量,自变量纳入尿外泌体CD26表达水平和各临床因素进行多元Logistic回归分析。最后进行敏感性分析,在AKI存活者中,通过制作ROC曲线,研究尿外泌体CD26对三个肾功能恢复终点的预测能力,并分亚组进行分析。以上分析,生存分析和ROC曲线应用GraphPad Prism 8进行分析,余统计过程均应用SPSS 17.0进行。4 结果4.1研究对象纳入研究对象为山东大学齐鲁医院重症医学科住院的成年患者,共入组AKI队列133人,非AKI对照组68人。4.2提取的外泌体形态与大小应用透射电镜和动态光散射测量结果显示提取的尿液外泌体形态与大小符合文献报道的经典外泌体特征,不含细胞碎片、微粒等其他细胞成分,可以用于下一步检测。4.3提取的外泌体生物标志物Western blot与流式细胞检测术显示 CD63,CD81,GRP94,Calnexin,CD61以及TSG101在所提取的外泌体中表达丰富。4.4 AKI队列与对照组临床特征及尿外泌体CD26的比较基线特征进行比较:两组间年龄、性别、非肾脏APACHEII评分匹配。AKI组住院死亡率显着增高。两组间住院时间和住ICU时间相比较,均无明显差异。AKI组CD26+尿外泌体比率显着低于对照组,6.4%（1.2%-22.0%）vs.23.9%,（6.6%-64.5%）;p<0.001。4.5尿外泌体CD26与临床指标的相关性分析CD26+尿外泌体比率与非肾脏APACHE II评分、糖尿病、慢性肾病（CKD）及AKI呈负相关,与外科术后呈正相关,与余临床指标不相关。多元线性相关分析显示,仅AKI与CD26+尿外泌体比率独立相关adjusted β=-15.95（-23.60,-8.29）,p<0.001。4.6尿外泌体CD26表达高/低两组间临床特点的比较以中位数为界值,定义CD26+尿外泌体比率≥6.4%为尿外泌体CD26高表达（n=67）,CD26+尿外泌体比率<6.4%为尿外泌体CD26低表达（n=66）。尿外泌体高表达和低表达组之间进行临床特点的比较,显示两组间年龄、性别、APACHEII评分及非肾脏APACHE II评分相匹配。比较两组间住院时间、住ICU时间及住院死亡率无显着性差异。高表达组院内接受RRT比率显着低表达组（p=0.016）,早期肾功能恢复、院内肾功能恢复显着高于低表达组（p<0.05）,而出院肾功能恢复率无显着性差异。4.7尿外泌体CD26表达与AKI分期之间的关系尿外泌体CD26表达高/低两组间比较AKI 3个分期的构成,结果显示无统计学差异（p=0.084）。将CD26+尿外泌体比率作为连续变量,在AKI 3个分期间进行比较,两两比较各组无差异。因此,尿外泌体CD26与AKI的分期无显着性关系。提示,尿外泌体CD26表达与肾损伤的严重程度无关。4.8尿外泌体CD26表达与AKI患者预后的关系4.8.1尿外泌体CD26与MAKE 90的关系针对复合终点MAKE的组成成分逐一进行分析。为分析尿外泌体CD26与死亡终点的关系,首先在出院存活与死亡患者间比较CD26+尿外泌体比率无显着性差异。尿外泌体CD26表达高/低两组间比较住院死亡率无显着差异。最后在高表达组和低表达组间比较90天死亡率,Kaplan-Meier分析显示CD26高表达组与CD26低表达组90天死亡率无显着差异（p=0.907）。以上结果提示,尿外泌体CD26与近期死亡无关。对MAKE的另一成分——接受RRT治疗,与尿外泌体CD26的关系进行分析。CD26高表达组较低表达组院内应用RRT的比率显着降低（p=0.016）。KM分析显示,CD26高表达组90天内接受RRT比率显着低于低水平组（p=0.013）。提示,CD26高表达预示90天内RRT应用风险较低。对MAKE的最后一个成分——持续肾功能恶化进行分析。KM分析显示,90天内持续肾功能恶化在两组间无统计学差异（p=0.717）。对复合终点MAKE进行分析,CD26高表达组90天内MAKE的发生率显着低于CD26低表达组,具有统计学差异（p=0.018）,主要是RRT应用这一结局的影响。提示,尿外泌体CD26高表达预示近期内MAKE发生风险较低,较好的肾脏相关预后。4.8.2尿外泌体CD26与肾功能恢复的关系4.8.2.1尿外泌体CD26与28天内肾功能恢复的关系Kaplan-Meier分析比较AKI患者尿外泌体CD26高/低表达组间28天内肾功能恢复发生率,结果显示高表达组28天内肾恢复率显着高于CD26低表达组（p<0.001）。进一步的多因素Cox回归分析,尿外泌体CD26 表达水平进入方程（HR,1.90;95%CI,1.15-3.14;p=0.012）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进AKI肾功能恢复。4.8.2.2 AKI存活者中尿外泌体CD26与肾功能恢复终点的关系AKI组81名存活者,依据3个肾功能结局进行分组,分别为早期肾功能恢复组/早期肾功能未恢复组、出院肾功能恢复组/出院肾功能未恢复组、院内恢复组/院内肾功能未恢复组,分别比较3组CD26+尿外泌体比率,显示各良好结局组CD26+尿外泌体比率均显着高于不良结局组（p<0.05）。在CD26表达高/低两组间比较肾功能早期恢复的差异,高表达组29（72.5%）例患者早期恢复,而低表达组仅有15（3 6.6%）例患者早期恢复,卡方检验显示两组间早期肾功能恢复存在显着差异（OR=4.57,p=0.001）。逐步多元Logistic回归分析显示,早期肾功能恢复与AKI分期及尿外泌体CD26表达水平独立相关（OR=4.67,p=0.007）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进早期肾功能恢复的因素。在CD26高/低表达两组间比较肾功能出院恢复的差异,高表达组34（85.0%）名患者出院恢复,而低表达组有23（56.1%）名患者出院恢复,卡方检验显示两组间出院肾功能恢复存在显着差异（OR=4.44,p=0.004）。以出院肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期和尿外泌体CD26表达水平（OR=3.50,p=0.039）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进出院肾功能恢复的因素。在CD26表达高/低两组间比较院内肾功能恢复,高表达组35（87.5%）例患者院内肾功能恢复,低表达组有23（56.1%）例患者在院期间肾功能恢复,存在显着差异（OR=5.48,p=0.002）。以院内肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期以及CD26表达水平（OR=4.66,p=0.019）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进院内肾功能恢复。4.8.3尿外泌体CD26对肾功能恢复终点的预测价值CD26+尿外泌体比率在AKI存活者中分别预测早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复,经ROC方法检测仅对早期肾功能恢复的预测具有统计学意义,曲线下面积（AUROC）为0.65（0.53-0.77）,p=0.021。对于出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测不能达到统计学意义。利用预测早期肾功能恢复的ROC曲线选取曲线上最佳截断值,为6.8%。利用该值计算尿外泌体CD26对3个肾功能恢复终点的预测能力,显示其对出院肾功能恢复和院内肾功能恢复有较高的特异性和阳性预测值。分析显示,大于此截断值的患者其中90%的患者将在院期间发生肾功能恢复。提示,尿外泌体CD26对肾功能转归的预测具有一定的临床应用价值。进一步在亚组中检测尿外泌体对3个肾功能恢复终点的预测能力。因为脓毒症是AKI最重要的病因,按是否合并脓毒症分类后,显示在非脓毒症相关AKI的患者中尿外泌体CD26的预测价值显着提高,预测早期肾功能恢复:AUROC=0.71,p=0.046;预测出院肾功能恢复:AUROC=0.79,p=0.009;预测院内肾功能恢复:AUROC=0.83,p=0.003。提示,在非脓毒症相关AKI患者,尿外泌体CD26对肾功能恢复有较强的预测价值,值得进一步研究。5结论（1）尿外泌体CD26表达的降低与重症患者AKI的发生相关,但尿外泌体CD26表达水平与AKI肾损伤的严重程度不相关;（2）尿外泌体CD26与近期死亡率不相关,但尿外泌体CD26与90天内主要肾脏不良事件发生率相关,尿外泌体CD26高表达预示着较低的90天内主要肾脏不良事件发生风险;（3）尿外泌体CD26与肾功能恢复独立相关,尿外泌体CD26高表达可预测AKI早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复。利用尿外泌体CD26早期预测肾功能转归,实现个体化精准治疗,以期能改善患者的长期预后。1 研究背景急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是住院患者尤其重症患者的严重并发症,除导致住院死亡率显着升高外,会导致长期死亡率升高和慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）及终末期肾病的发病率增加,造成沉重的疾病负担。目前对于AKI尚无有效的预防或治疗措施,仍为支持治疗。外泌体是一种细胞外囊泡,广泛存在于各种体液中。其脂质双分子层携带来源细胞的蛋白及核酸的结构使其作为一种细胞间信使,通过与受体细胞结合,广泛参与各种生理及病理过程的调节。外泌体作为疾病诊断和预后标志物越来越受到重视,已发现数种外泌体蛋白及RNAs与AKI有关。晚近的几项研究发现,外源性的外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进肾功能恢复,但其作用机制及关键分子尚不清楚。论文I的研究发现,与对照组相比,AKI患者尿外泌体CD26表达显着降低;而AKI患者队列内部,尿外泌体CD26高表达组比低表达组有更高的出院肾功能恢复率;经过校正性别、年龄、慢性合并症、急性病因、危重程度、AKI分期之后,尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复等肾脏预后仍有独立的关联。因肾小球滤过膜的存在,尿外泌体较少来自于循环,肾脏细胞是尿外泌体的主要来源。由此我们推断表达CD26的肾脏细胞来源的外泌体可能有减轻肾脏损伤、促进肾脏修复的功能。CD26是细胞表面的跨膜糖蛋白,通常也被称作Dipeptidyl peptidase-4（DPP4）。其具备丝氨酸蛋白酶活性,广泛表达于多种类型的细胞中,在肾脏其表达于肾小球足细胞的基底膜,并高度表达于远端肾小管上皮细胞（TEC）的刷状缘微绒毛。研究发现CD26与细胞增殖、炎症调节等过程相关。TEC的再生是AKI修复的主要环节,研究发现CD26有促进细胞增殖的作用。并且CD26参与炎症反应的调节,其底物包含一些系列趋化性细胞因子。AKI主要病理过程发生于TEC,尤其远端TEC的损伤、坏死或凋亡,进而炎症细胞浸润、间质炎症反应的发生。肾脏修复主要过程为TEC的增生,替代丧失的TEC、修复肾小管上皮组织,炎症反应参与调控这一过程。良好的增生和调控,导致完全的修复和肾功能的恢复;反之则导致纤维化的加重,最终导致CKD。因此,我们假设CD26+外泌体可能通过促进TEC增生,抑制炎症反应,减轻纤维化,减轻肾损伤、促进肾脏修复。由此,我们拟通过体外培养小鼠肾小管上皮细胞系TCMK1,通过体外模拟AKI的主要致病过程缺血再灌注（ischemia/reperfusion injury,IR）,获取培养基上清中的生理外泌体（ExoNormal）,IR程序获取ExoIR,探索生理与IR条件下尿液中CD26的表达。过表达CD26腺病毒载转染TCMK1,构建TEC来源的CD267过表达的外泌体（ExoCD26）;利用手术构建IR相关的AKI小鼠动物模型,进一步利用外泌体进行干预,通过与对照组在肾脏功能、组织病理及增生、炎症等指标对照间的比较,探讨CD26+外泌体对AKI肾脏修复的影响,及其可能的机制。2 目的（1）体外实验中探讨缺血再灌注对肾小管上皮细胞（TEC）外泌体中CD26表达的影响;（2）利用CD26过表达的腺病毒载体转染肾小管上皮细胞,构建CD26过表达的TEC外泌体;（3）IR-AKI动物体内,示踪TEC外泌体能否被肾脏细胞摄取;（4）通过体内实验,探讨CD26过表达外泌体能否减轻肾损伤、促进肾脏修复,并探讨其可能的机制。3方法3.1细胞培养及病毒转染TCMKI细胞分别常规培养及缺血缺氧程序培养,两种培养条件下的细胞均按标准程序转染CD26过表达腺病毒与空载体。留取细胞培养基上清。3.2外泌体分离纯化及表达鉴定用超速差速离心法提取TCMK-1小鼠肾小管细胞上清中的外泌体。分别对常规培养细胞释放的外泌体ExoNormal,缺氧培养细胞释放的外泌体ExoIR,正常培养条件下CD26转染后细胞释放外泌体ExoCD26,及缺氧培养并转染的细胞释放的外泌体ExoIR+CD26,分别进行CD26表达的检测。外泌体与抗CD26抗体和荧光素结合的二抗充分反应后,加入流式细胞分析。3.3 AKI（IR）动物模型的建立C57BI/6雄性成年小鼠（8周）,戊巴比妥麻醉后,显微镜下,一侧肾蒂紧密结扎后,将肾脏切除;对侧肾动脉用动脉夹夹闭,观察肾脏变色,呈缺血改变,覆盖湿润纱布,夹闭30分钟。3.4外泌体的体内示踪避光条件下操作,使用PKH26标记外泌体,经尾静脉注入IR小鼠体内;分别于注射15分钟、2小时及12小时在麻醉下取肾脏组织;OCT包埋组织块,制成冰冻切片;切片经双蒸水水化、PBS清洗后,应用BSA终止反应;加入AQP1一抗,4度湿盒孵育过夜后,PBS清洗,加入荧光素偶联的AQP1二抗,37℃孵育30分钟,PBS清洗,DAPI染色、封片,即刻荧光显微镜下观察。3.5 IR小鼠干预措施及分组分为对照组,IR+BSA 组,IR+ExoNormal 组,1IR+ExoIR组,IR+ExoCD26组,每组各10只;对照组不做肾脏处理,余操作同IR手术各组;IR各组于手术后12h分别经尾静脉注入等蛋白质量的BSA,ExoNormal,ExoIR及ExoCD26进行干预。3.6 肾功能指标检测干预后72h,取血样。各血样离心后,保存血清。分别应用尿素氮和肌酐试剂盒进行检测,以得出尿素氮和肌酐的浓度数值。3.7 肾脏组织病理学检测干预后72h,进行肾脏取材。各肾脏组织分别进行HE染色和PAS染色,显示肾小管上皮损伤情况,并用半定量的方法,在各组间进行比较。3.8 肾脏增殖指标的检测免疫荧光技术检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）在各组肾脏的表达;Western blot的方法检测p21和p53在肾脏的表达。3.9 肾脏炎症指标的检测免疫荧光技术分别应用抗MOMA2抗体、抗neutrophil抗体及抗CXCR4抗体显示巨噬细胞、中性粒细胞在肾脏的浸润和趋化性细胞受体CXCR4在肾脏的表达。并应用Western blot的方法检测趋化性细胞因子SDF-1（CXCR4的配体）在肾脏的分布。3.10肾脏纤维化指标的检测Western blot的方法测定1型胶原在各组肾脏中的表达。4 结果4.1 外泌体鉴定电镜下可见纯化成分为双凹圆盘状的高电子密度囊泡,大多直径位于30-150nm;使用动态光散射技术检测微粒的粒径大小,结果提示分离纯化的囊泡直径呈单峰分布,平均直径在30-100nm左右。结果提示,使用经典的超速差速离心方法获得的为典型的外泌体囊泡,可用于下一步功能试验。4.2外泌体中CD26表达分析流式细胞分析显示,生理条件下TCMK-1细胞培养液上清中分离纯化的外泌体ExoNormal中CD26表达量较少,经过IR程序的TCMK-1细胞上清外泌体ExoIR中CD26表达轻度增加。分别向TCMK-1细胞系（常规条件培养）转染空载体病毒Vector和过表达CD26的病毒（VirusCD2）。病毒转染后,细胞系培养液上清分离纯化外泌体,流式测得该外泌体高度表达CD26,阳性率大于70%,即ExoCD26。同样方法转染缺氧条件下培养的TCMK-1细胞系,从细胞培养液上清采集的外泌体（ExoIR+CD26）,也高度表达CD26,与ExoCD26相似。各组外泌体进行western blot检测,显示ExoNormal对CD26的表达均少,ExoIR对CD26的表达较ExoNormal轻度增加;常规培养的细胞系转染VirusCD26后释放的外泌体（ExoCD26）对CD26表达显着增加;缺氧条件下培养的细胞系,转染VirusCD26后,其外泌体（ExoIR+CD26）对CD26的表达也显着增加,与ExoCD26无明显差异。4.3 AKI动物模型的鉴定经过一侧肾动脉钳夹,对侧肾脏切除,72h后小鼠血尿素氮、肌酐显着升高,肾脏组织出现IR病理学改变,证实AKI造模成功。4.4动物体内外泌体示踪PKH26标记的外泌体通过尾静脉注入IR小鼠体内,2h后取材,制冰冻切片,荧光标记AQP1。显示肾小管上皮细胞内可见外泌体荧光标记,肾脏其他类型细胞内未见外泌体荧光标记。提示,肾小管上皮细胞（TEC）来源的外泌体选择性的被TEC所摄取。4.5外泌体对肾脏功能指标的影响IR小鼠血清尿素尿素氮及肌酐水平显着增高:与BSA相比,ExoNormal及ExoIR对肾功能指标无影响,而ExoCD26显着降低了血清尿素氮和肌酐水平。4.6外泌体对肾脏组织损伤的影响HE染色及PAS染色显示,IR小鼠肾脏出现明显损伤,包含肾小管扩张,刷状缘缺失,肾小管上皮细胞的坏死,管型的形成等;与BSA相比,ExoNomal及ExoIR未能减轻肾脏损伤,而ExoCD26显着降低了肾损伤评分和损伤肾小管分数,减轻了肾脏组织损伤。4.7外泌体对TECs增生的影响免疫荧光染色示,IR小鼠肾脏增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）显着降低;与 BSA 相比,ExoNormal 及 ExoIR 未能增加PCNA的表达,而ExoCD26显着增加了 PCNA的表达,PCNA沿肾小管分布。此外,IR小鼠肾脏p21和p53表达显着升高,提示细胞分裂增生的阻滞;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能降低p21和p53的表达,但ExoCD26显着降低了两者的表达。以上结果提示,ExoCD26促进了 TECs细胞的增生。4.8外泌体对肾脏炎症反应的影响免疫荧光显示,IR肾脏中性粒细胞、巨噬细胞浸润显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着降低中性粒细胞和巨噬细胞的浸润,而ExoCD26显着降低了两种炎症细胞的浸润。同时,Western blot和免疫荧光结果显示,SDF-1和CXCR4这一对趋化因子及受体在IR肾脏表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能明显改变其表达,但ExoCD26显着降低了两者表达。提示,ExoCD26能降低趋化性细胞因子及受体的表达,并改善炎症细胞的浸润。4.9外泌体对肾脏纤维化的影响Western blot结果显示,IR肾脏1型胶原表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着改变其表达,而ExoCD26显着降低了 1型胶原表达。提示,ExoCD26抑制早期肾纤维化。5.结论（1）缺血再灌注使肾小管上皮细胞系来源的外泌体CD26的表达增加;（2）肾小管上皮细胞系来源的外泌体在IR-AKI小鼠动物模型体内,可被TEC摄取;（3）ExoCD26可改善AKI小鼠肾脏功能指标,减轻肾脏损伤,其可能的机制是ExoCD26被TEC摄取后,促进TEC增殖,减轻肾脏炎症反应和纤维化,从而促进肾脏的修复。
李丹[3]（2021）在《电针预处理对高血糖小鼠肾脏保护效应及机制的研究》文中进行了进一步梳理目的肾脏是对高血糖最敏感、亦是累及最早的器官。高血糖可直接引起肾组织损伤,进一步则导致肾脏出现不可逆功能受损。本研究遵循中医“治未病”的学术思想,选取“足三里”、“肾俞”穴,采用电针预处理的方式对链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导的高血糖小鼠进行干预,以瞬时受体电位阳离子通道6（transient receptor potential cation channel 6,TRPC6）为切入点,探讨电针预处理减轻高血糖小鼠肾损伤的效应及其机制。方法采用4～6周龄雄性C57BL/6小鼠125只,体重18±2g,适应性喂养一周后开始实验,本实验过程中对动物的处置严格按照科技部[2006]398号《关于善待实验动物的指导性意见》文件要求进行,并已通过湖北中医药大学实验动物伦理委员会审批（审批编号:HUCMS201809011）。将125只小鼠按随机数字表法分为随机分为6组。人近端肾小管细胞系（Human Proximal Tubular Cells,HK-2）分为3组。动物分组（1）对照组（C,n=20）:正常喂养,不予其他干预。（2）模型组（M,n=20）:实验1～7d与电针预处理组以相同方式固定小鼠,实验8～12 d腹腔注射1%STZ溶液（50 mg/kg体重/天）。（3）电针预处理组（E,n=25）:实验1～7 d取“足三里”、“肾俞”穴行电针预处理,采用0.18 mm×13 mm无菌针灸针进行针刺,“足三里”直刺,深度3 mm,“肾俞”向内下方斜刺4 mm,连接HANS-200电针治疗仪,采用疏密波,频率为2 Hz/15 Hz,梯度电流,0.3 m A持续5 min,0.4 m A持续5 min,0.5 m A持续20 min,共30 min,每日1次,共处理7 d。其中5只提取针刺血清用于细胞培养,只进行电针预处理,不做其他检测。剩余20只小鼠在实验8～12d腹腔注射STZ溶液,方式同模型组。（4）假电针组（S,n=20）:实验1～7 d固定方法及选穴同电针预处理组,针刺穴位皮下,不接电极,每次留针30 min,每日1次,共处理7 d。实验8～12 d腹腔注射STZ溶液,方式同模型组。（5）电针预处理+TRPC6激动剂组（ET,n=20）:于实验第1 d、4 d腹腔注射Hyperforin dicyclohexylammonium salt（HP）溶液（5mg/kg）,其余操作同电针预处理组。（6）模型+TRPC6激动剂组（MT,n=20）:HP溶液用药方式同上,其余操作同模型组。细胞分组将HK-2细胞系分为3组（1）正常组:5mmol/L葡萄糖培养细胞（2）高糖组:25mmol/L葡萄糖培养细胞（3）针刺血清组:针刺血清+25mmol/L葡萄糖培养细胞以上三组细胞培养72 h后开始检测。检测方法（1）于实验第0 d及第15 d称量小鼠体重,检测血糖,计量其当日摄食及排泄量。（2）第15 d血糖检测完成后,取小鼠右肾部分组织进行透射电镜检查,剩余部分提取肾组织蛋白;左肾固定后石蜡包埋,沿肾脏矢状面切片。（3）采用HE染色观察肾组织形态,统计肾小球切面面积及受损肾小管比例;Masson和PAS染色观察和评估小鼠肾小球球内系膜基质增生程度;采用透射电镜观察各组小鼠足细胞足突变化情况;（4）采用免疫组化法及免疫印迹法（Western-Blot,WB）检肾组织足细胞相关蛋白Neprin、WT1、Desmin表达、凋亡相关蛋白Caspase 3、Bcl-2/Bax表达及TRPC6蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平。（5）采用Tunel法检测肾小管上皮细胞凋亡。（6）采用钙影像检测HK-2细胞内Ca2+水平。结果1.“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠血糖水平的影响。与对照组比较（6.83±0.43 mmol/L）,模型组小鼠血糖（13.17±0.46mmol/L）显着升高（P<0.0001）;与模型组比较,电针预处理组小鼠血糖（10.61±0.7 mmol/L）明显降低（P<0.01）;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组小鼠血糖（12.32±1.05 mmol/L）上升（P<0.05）,与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组（14.43±0.76mmol/L）小鼠血糖上升（P<0.05）。与对照组比较,模型组小鼠摄食量显着增加（P<0.0001）,与模型组比较,电针预处理组小鼠摄食量明显减少（P<0.01）;与电针组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组小鼠摄食量明显增加（P<0.01）,与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组小鼠摄食量明显增加（P<0.01）。与对照组比较,模型组小鼠排泄量显着增加（P<0.0001）,与模型组比较,电针预处理组小鼠排泄量明显减少（P<0.01）;与电针组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组小鼠排泄量明显增加（P<0.01）,与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组小鼠排泄量明显增加（P<0.01）;2.“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠肾组织损伤的影响HE染色可见,与对照组比较,模型组小鼠肾脏肾小球体积明显增大（P<0.0001）,近端小管刷状缘大量消失（P<0.0001）;与模型组比较,电针预处理组小鼠肾脏肾小球体积较小（P<0.05）,近端小管刷状缘消失亦较少（P<0.0001）;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组肾小球显着增大（P<0.0001）,肾小管刷装缘消失增多（P<0.05）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组小鼠肾小球显着增大（P<0.0001）,刷状缘消失的近端小管比例增加（P<0.05）。Masson及PAS染色可见,与对照组比较,模型组小鼠肾小球球内系膜基质明显增生;与模型组比较,电针预处理组球内系膜基质增生不明显;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组球内系膜基质增生更明显;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组球内系膜基质增生更明显。3.“足三里”、“肾俞”电针预处理对足细胞损伤的影响采用透射电镜观察各组小鼠足突变化,结果显示:模型组及假电针组小鼠足突出现明显回缩、融合,电针预处理组足突变化不明显。采用免疫组化法检测各组小鼠肾脏Desmin蛋白的表达,与对照组比较,模型组Desmin蛋白表达显着增加（P<0.0001）;与模型组比较,电针预处理组Desmin蛋白表达明显降低（P<0.01）。与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达显着增加（P<0.001）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达明显增加（P<0.01）。Western-blot法检测各组小鼠肾脏Desmin蛋白的表达与对照组比较,模型组Desmin蛋白表达明显增加（P<0.0001）;与模型组比较,电针预处理组Desmin蛋白表达显着降低（P<0.001）。与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达明显增加（P<0.01）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达明显增加（P<0.01）。免疫组化检测各组小鼠肾组织Nephrin的表达,结果显示:与对照组比较,模型组Nephrin表达明显上调（P<0.01）,与模型组比较,电针预处理组Nephrin表达下调（P<0.05）;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组Nephrin表达上调（P<0.05）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组Nephrin表达上调（P<0.05）。WB检测各组小鼠肾组织Nephrin的表达水平,结果显示:与对照组比较,模型组Nephrin表达水平明显上调（P<0.01）,与模型组比较,电针预处理组Nephrin表达水平下调（P<0.05）;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组Nephrin表达水平明显上调（P<0.01）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组Nephrin表达水平上调（P<0.05）。采用免疫组化检测肾脏WT1蛋白表达及定位,肾小球内的阳性细胞即为足细胞,统计各组足细胞数,结果显示各组足细胞数量差异无统计学意义。4.“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响与对照组比较,模型组小鼠肾小管上皮细胞凋亡比例显着增加（P<0.0001）;与模型组比较,电针预处理组肾小管上皮细胞凋亡比例显着减少（P<0.0001）;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组肾小管上皮细胞凋亡比例显着增加（P<0.0001）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组肾小管上皮细胞凋亡比例明显增加（P<0.01）。免疫组化检测各组小鼠肾组织Caspase3的表达,结果显示:与对照组比较,模型组Caspase3表达水平显着上调（P<0.001）,与模型组比较,电针预处理组Caspase3表达水平明显下调（P<0.01）;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平上调（P<0.05）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平上调（P<0.05）。WB检测各组小鼠肾组织Caspase3的表达水平,结果显示:与对照组比较,模型组Caspase3表达水平显着上调（P<0.0001）,与模型组比较,电针预处理组Caspase3表达水平显着下调（P<0.0001）;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平明显上调（P<0.001）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平明显上调（P<0.01）。WB检测各组小鼠肾组织Bax/Bcl-2的表达比值,结果显示:与对照组比较,模型组Bcl-2/Bax比值显着降低（P<0.0001）,与模型组比较,电针预处理组Bcl-2/Bax比值明显明显升高（P<0.001）;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组Bcl-2/Bax比值明显显着降低（P<0.001）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组Bcl-2/Bax比值明显明显降低（P<0.01）。5“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠肾肾脏TRPC6表达及ERK磷酸化的影响（1）免疫组化法检测各组小鼠肾脏TRPC6的表达,结果显示:与对照组比较,模型组TRPC6表达水平显着上调（P<0.001）,与模型组比较,电针预处理组TRPC6表达水平下调（P<0.05）;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组肾小球区域TRPC6表达水平上调（P<0.05）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组肾小球区域TRPC6表达水平上调（P<0.05）。WB的结果显示:与对照组比较,模型组TRPC6表达水平明显上调（P<0.01）,与模型组比较,电针预处理组TRPC6表达水平下调（P<0.05）;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组TRPC6表达水平明显上调（P<0.01）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组TRPC6表达水平明显上调（P<0.01）。免疫组化WB检测各组小鼠肾组织ERK磷酸化水平,结果显示:与对照组比较,模型组ERK磷酸化水平明显上调（P<0.01）,与模型组比较,电针预处理组ERK磷酸化水平明显下调（P<0.05）;与电针预处理组比较,电针预处理+TRPC6激动剂组ERK磷酸化水平明显上调（P<0.01）;与模型组比较,模型+TRPC6激动剂组ERK磷酸化水平明显上调（P<0.01）。各组JNK及P38磷酸化水平差异无统计学意义。6.针刺血清对HK-2细胞内Ca2+浓度的影响采用钙影像检测各组HK-2细胞内Ca2+浓度,结果显示,与正常组HK-2细胞比较,高糖组HK-2细胞内Ca2+浓度明显升高（P<0.01）,与高糖组比较,针刺血清培养的HK-2细胞内Ca2+浓度显着降低（P<0.001）。结论（1）“足三里”、“肾俞”电针预处理可明显抑制STZ诱导的小鼠血糖升高、改善小鼠一般状况。（2）“足三里”、“肾俞”电针预处理可通过减少足细胞损伤、抑制肾小管上皮细胞凋亡发挥肾脏保护效应。（3）“足三里”、“肾俞”电针预处理的肾脏保护效应可能是通过下调TRPC6的表达、减少ERK磷酸化实现的。
张欢[4]（2021）在《SAHA通过调控TGFβ/Smad信号通路在结晶肾损伤模型EMT中的作用及机制研究》文中提出慢性肾脏病已经成为一个全球的公共卫生问题,随着终末期肾衰患者的逐年增长,对我国的医疗和经济形成了巨大的负担。梗阻性肾病是引起肾功能衰竭的重要病因,最常见的病因为泌尿系结石,其中主要的成分为草酸钙结石。随着病程迁延反复,结石所导致的梗阻性肾病已成为慢性肾脏病进展的主要病因之一。草酸钙是泌尿系结石的主要组成成分,草酸钙结石占泌尿系结石的80%以上。然而关于肾脏草酸钙结石形成的机制目前仍不十分明确,可能有多种因素参与结石形成,涉及免疫、氧化应激、肾乳头钙斑、多因素等,这些机制研究认为多种因素参与导致的肾小管损伤可能进一步促进结晶的成核、沉积。因此,肾小管损伤可能成为研究肾结石形成一个新的方向。我们结石团队前期的研究结果提示早在草酸钙结晶形成期,既有氧化应激、细胞凋亡、自噬的参与,亦发现有肾小管上皮细胞间质转分化（epithelial mesenchymal transition EMT）的发生,这些因素相互影响可进一步导致肾间质纤维化,加重肾脏病的进展。在此基础上,本课题拟进一步研究在草酸钙结晶形成期,在肾小管上皮细胞损伤发生改变的进程中TGFβ/Smad信号通路的作用,是否可通过乙酰化/去乙酰化的调控通过TGFβ/Smad信号通路抑制结晶肾损伤EMT的发生,延缓肾纤维化的进程,为临床治疗提供新的思路和理论基础。第一部分:基因芯片技术分析TGF-β对于肾小管上皮细胞的作用目的:通过基因芯片技术分析TGF-β刺激HK2细胞,筛选出差异表达基因,然后进一步进行下游的生物信息学分析,筛选和分析TGF-β1对于肾小管上皮细胞的作用和影响。方法:1.运用GEO自带的GEO2R工具对HK-2细胞的48小时对照组和TGF-β1处理组（每组各三个独立重复样本）进行差异基因分析,并且下载R语句在R4.0.3环境中进行进一步整理分析,筛选DEGs。2.使用Benjamini and Hochberg（BH）法将p值调整为错误发现率（false discovery rate,FDR）,并选取FDR<0.05而且log fold change绝对值（|log FC|）>2作为阈值,得到该数据集的DEGs。3.用STRING11.0（https://string-db.org/）进行DEG编码蛋白的相互作用网络分析。结果:1.使用基因芯片技术,从TGFβ刺激的HK2细胞GSE20247数据集中筛选出269个DEGs,其中TGF-β1处理组上调表达基因112个,下调表达基因157个。2.从TGFβ刺激的HK2细胞基因表达谱芯片分析,DEGs分析与GSEA分析发现与TGFβ1/SMAD通路以及EMT相关的24条功能信号通路在TGF-β1处理以后的HK-2细胞中富集。结论:通过对两组基因表达数据的基因芯片分析,与TGFβ1/SMAD通路以及EMT相关的功能信号通路在TGF-β1处理以后的HK-2细胞中富集,所以TGFβ1是肾小管上皮细胞HK2发生EMT现象的重要刺激因素,TGFβ1/Smad通路是其关键通路。第二部分:草酸钙结晶肾损伤模型的构建目的:研究构建合适的草酸结晶肾体外模型,观察TGFβ1/Smad如何参与肾小管上皮细胞损伤的进程,是否可通过调控TGFβ1/SMAD通路从而抑制结晶肾损伤EMT的发生,延缓慢性肾纤维化的进程。方法:1.使用流式细胞技术检测不同浓度草酸钠刺激HK2细胞,HK-2细胞凋亡、线粒体膜电位、胞内ROS的影响;2.不同作用时间条件下,草酸钠对HK2细胞凋亡的影响;3.检测时间梯度、浓度梯度下,HK-2细胞EMT通路相关蛋白表达变化。4.检测草酸钠结晶肾损伤细胞模型中TGFβ/Smad通路蛋白的表达情况。结果:1.流式细胞检测结果显示,随着不同草酸钠浓度（0m M、0.5m M、1m M、2m M、4m M）逐渐增加,细胞凋亡逐渐增加,与空白对照组比较p<0.05。2.当设定草酸钠浓度为1m M时,随着草酸钠作用时间的延长,HK2细胞凋亡明显增加,与对照组相比差异有统计学意义（p<0.05）。3.Smad2、Smad3、Smad7、HDAC1、TGFβ1、TGFBR等基因表达的差异。与空白对照组HK-2细胞相比,Smad2呈现上调,Smad3呈现上调,Smad7自0.5m M浓度草酸钠处理后细胞上升后,后出现浓度梯度依赖的下调。HDAC1、TGFβ、TGFBR均出现草酸钠浓度依赖的上调。4.经过不同时间1m M草酸钠培养液培养后,与空白对照组相比,Smad7呈现下调,作用至12h后,出现上调,但对比空白组仍是下调（p<0.05）。HDAC1呈现上调,TGFβ、TGFBR均出现时间依赖的上调（p<0.05）。上皮细胞标志物E-cadherin呈现时间依赖的下调。间质标志物Vimentin呈现时间依赖的上调。4.1m M草酸作用HK2细胞24小时条件下,Smad2/3、TGFβ的蛋白水平随着草酸刺激时间延长而逐渐上调,上皮细胞标志物ZO-1随着草酸作用时间延长而逐渐下调。结论:中等浓度的草酸（1m M）刺激24小时HK-2细胞可能是比较适宜的结晶肾损伤模型的条件,在这个过程中,出现了TGFβ/Smads信号通路相关蛋白的表达增加,以及EMT的发生。在模型中,随着草酸作用时间的增加,HDAC1表达随之增加。第三部分:SAHA调控TGFβ/Smad信号通路影响草酸钙结晶肾损伤模型中EMT表达目的:探讨通过SAHA对其调控,抑制TGF-β/Smad信号传导,减少EMT,保护肾纤维化。方法:流式细胞学检测去乙酰化酶抑制剂SAHA对结晶肾损伤模型细胞凋亡的影响。westernblot检测SAHA对结晶肾损伤模型TGFβ/Smad通路的影响。Westernblot及免疫荧光检测SAHA对结晶肾损伤模型EMT的影响。结果:1.在草酸刺激HK2细胞结晶肾损伤模型中,相对空白对照组,TGFβ/Smads信号通路蛋白出现了明显的上调,并且导致肾小管细胞失去了上皮细胞形态,出现了上皮标志物下调,间质标志物上调的EMT现象。2.去乙酰化酶抑制剂SAHA通过下调TGFβ/Smads信号通路,改善了模型组出现的EMT现象。结论:SAHA可以通过下调TGFβ/Smads信号通路,改善草酸刺激HK2结晶肾损伤模型的EMT现象,改善肾纤维化。
郭晓媛[5]（2021）在《滋肾丸干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡作用及机制研究》文中认为[目的]探究滋肾丸（ZiShenWan,ZSW）对糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）肾小管上皮细胞焦亡的干预作用及机制,通过网络药理学研究分析ZSW治疗DN的靶点及通路,为ZSW治疗DN提供科学依据。[方法]1.动物实验:采取随机对照方法,将雄性6周龄db/db小鼠分为模型组、阳性对照组、ZSW高剂量组、ZSW中剂量组、ZSW低剂量组（n=10）;非糖尿病db/m小鼠为正常对照组（n=10）。适应性喂养2周后,ZSW各剂量组给予ZSW乙醇提取物灌胃（高剂量:6.0g/kg;中剂量:3.0g/kg;低剂量:1.5 g/kg）;阳性对照组给予达格列净灌胃（1.0mg/kg）;模型组和正常对照组同时给予等体积去离子水灌胃。每天灌胃1次,持续12周。每2周检测体重、尾静脉FBG;每4周检测尿液ACR、NAG酶、NGAL和CysC;给药12周后摘眼球取血,称量右肾脏重量,固定或冻存肾组织。血清检测HbA1c、BUN和CRE。肾组织经HE染色、PAS染色、Masson染色后光镜观察组织病理学改变,透射电镜观察超微结构改变,进行病理半定量评分;免疫组化染色观察分析肾小管上皮细胞上皮—间充质转化（EMT）标志物α-SMA和E-cadherin的表达强度;TUNEL染色观察分析肾小管上皮细胞核的损伤水平;Western blot及RT-qPCR分别检测NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1以及焦亡相关炎症因子IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18的蛋白及mRNA表达水平。2.细胞实验:正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2）进行复苏、传代及培养。通过MTT法检测细胞增殖活力筛选细胞培养条件及药物干预剂量,以高渗葡萄糖（45μmol/L）培养HK-2细胞48 h诱导焦亡及EMT,分为高糖组、ZSW低剂量组、ZWS中剂量组、ZSW高剂量组、阳性对照组。ZSW各剂量组给予ZSW乙醇提取物干预（高剂量:15μg/ml;中剂量:7.5μg/ml;低剂量:3.75μg/ml）;阳性对照组给予达格列净干预（0.1μmol/L）。另设空白组为正常对照、甘露醇组为高渗对照。光镜观察细胞形态改变;Transwell试验检测细胞迁移能力;TUNEL染色评估细胞核的损伤、LDH试验评估细胞膜的损伤、Annexin V/PI双染检测细胞焦亡水平;ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-18水平;Western blot 及 RT-qPCR 分别检测细胞 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、cleaved IL-1 β、IL-18的蛋白及mRNA表达水平。3.网络药理学:通过检索数据库筛选ZSW的药物活性成分和DN的疾病靶点,获得ZSW治疗DN的作用靶点;应用Cytoscape软件构建ZSW治疗DN的“药物—成分—靶点”网络,应用STRING数据库构建ZSW治疗DN的关键靶点的PPI网络,筛选ZSW治疗DN的核心关键靶点;应用Cytoscape软件和DAVID数据库进行基因功能和通路分析。[结果]1.动物实验:（1）药效学:与正常对照组相比,模型组FBG、HbAlc、BUN、血CRE及尿ACR、NAG酶、NGAL、CysC显着升高（P<0.01）。经ZSW干预后上述指标均显着降低（P<0.01）。（2）肾组织病理学:模型组肾小球出现体积增大、基底膜不均匀增厚、系膜基质增生;肾小管出现上皮细胞空泡变性、炎性细胞浸润;胶原纤维染色面积、基底膜厚度、肾小管损伤指数显着升高（P<0.01）。ZSW不同程度减轻上述病理改变,显着降低病理半定量评分（P<0.01）。（3）肾小管上皮细胞EMT:与正常对照组相比,模型组肾小管上皮细胞α-SMA表达强度、肾组织α-SMA蛋白及mRNA表达显着升高;肾小管上皮细胞E-cadherin表达强度、肾组织E-cadherin蛋白及mRNA表达显着降低（P<0.01）。ZSW显着改变肾小管上皮细胞α-SMA和E-cadherin表达强度,不同程度降低肾组织α-SMA蛋白及mRNA表达、升高肾组织E-cadherin的蛋白及mRNA表达（P<0.05或P<0.01）。（4）肾小管上皮细胞焦亡:与正常对照组相比,模型组肾小管上皮细胞核碎裂增多,TUNEL染色阳性率显着升高,肾组织IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）。ZSW减轻肾小管上皮细胞核碎裂,显着降低细胞TUNEL染色阳性率,显着降低肾组织IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达（P<0.01）。（5）肾组织NLRP3炎症小体活化:与正常对照组相比,模型组肾组织NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）,ZSW不同程度降低上述指标的蛋白表达（P<0.05或P<0.01）,显着降低NLRP3、ASC mRNA表达（P<0.01）,高剂量ZSW显着降低Caspase-1 mRNA表达（P<0.01）。2.细胞实验:（1）EMT:高糖培养使HK-2细胞形态发生间质细胞样改变,迁移能力显着增强,α-SMA蛋白及mRNA表达显着升高,E-cadherin蛋白及mRNA表达显着降低（P<0.01）;ZSW抑制高糖诱导的HK-2细胞的间质样改变,显着降低细胞迁移能力,显着降低α-SMA蛋白及mRNA表达,不同程度升高E-cadherin蛋白及mRNA表达（P<0.05或P<0.01）。（2）焦亡:高糖培养使HK-2细胞的细胞核及细胞膜损伤加重,焦亡水平升高,IL-1β、IL-18释放增加,IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）;ZSW明显减轻细胞核及细胞膜损伤,显着降低焦亡水平,显着减少IL-1β、IL-18释放以及 IL-1β、cleaved IL-1β 和 IL-18 蛋白及 mRNA 表达（P<0.01）。（3）NLRP3炎症小体活化:高糖培养使HK-2细胞NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）;ZSW不同程度降低上述指标的蛋白及mRNA表达（P<0.05 或 P<0.01）。3.网络药理学:经筛选获得ZSW的56个有效活性成分,与数据库中DN的疾病靶点映射获得166个ZSW治疗DN的靶点,与51个ZSW的有效活性成分共同构建“药物—成分—靶点”网络,通过PPI网络筛选获得154个关键核心靶点,诸多靶点涉及炎症反应相关,主要富集在钙通道复合体、膜区、突触和细胞质等细胞组分;G蛋白偶联受体活性、神经递质结合等分子功能;脂多糖介导的信号通路、氧化还原、突触传递等生物学过程;包含NOD样受体（NLR）信号通路在内的炎症反应、晚期糖基化终末产物、细胞增殖分化、内分泌抵抗、神经组织传导等相关信号通路。[结论]1.ZSW有效降低db/db小鼠血糖,减少尿蛋白,改善肾小管早期损伤指标及肾功能,减轻肾组织病理损伤,抑制肾小管上皮EMT及焦亡,可能是通过抑制NLRP3炎症小体活化实现的。2.ZSW有效抑制高糖诱导的HK-2细胞EMT及焦亡,可能是通过抑制NLRP3炎症小体活化实现的。3.ZSW中的多种有效成分多靶点、多通路治疗DN,干预炎症反应是ZSW治疗DN的重要作用机制。
张杰[6]（2021）在《E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景高血压作为心脑血管疾病发生的主要致病因素,同时也是导致肾脏发生损伤的重要原因。高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）是由原发性高血压导致的肾脏结构和功能的损害,是内科常见疾病之一,但其发病机制尚未完全清楚。高血压肾损害主要表现为蛋白尿增多、良性肾小球硬化、肾脏间质纤维化以及炎症细胞浸润。肾小管及间质的纤维化、炎症和免疫激活是导致HRD持续进展的重要因素。细胞外基质蛋白合成及其降解之间的平衡受损造成过量的基质沉积,这是纤维化过程的一个典型特征。炎症因子的分泌以及炎症细胞的浸润是肾脏纤维化的始动因素。目前还没有有效的方法可预防纤维化的进展,因此提高对HRD纤维化和炎症进展的细胞及分子机制的认识至关重要。目前研究中常见的HRD发病机制有遗传因素、盐敏感、氧化应激、内皮细胞功能障碍以及肾素-血管紧张素醛固酮系统（Renin-Angiotensin-Aldosterone System,RAAS）的激活。抑制RAAS的过度激活是目前减缓肾脏疾病进展的最有效的方法。血管紧张素Ⅱ（Angiotension Ⅱ,AngⅡ）作为RAAS的主要效应因子,主要通过血流动力学和非血流动力学两方面参与血压和靶器官损害的调节。它可作用于肾脏血管平滑肌细胞,导致血管收缩;它也可作为促炎剂,激活细胞内信号传导系统,促进肾脏的炎症反应;而且它可通过上调转化生长因子β1（Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1）的表达、增加成纤维细胞增殖,促进细胞外基质的合成、抑制细胞外基质的降解,加速肾脏纤维化的过程。因此,AngⅡ是HRD进展中的关键调节因子。泛素化修饰作为一种常见的蛋白质翻译后修饰,不仅是蛋白酶体降解目的蛋白的标记,也是蛋白-蛋白相互作用和酶激活的调节因素。目前研究发现多种E3泛素连接酶可调控高血压及其靶器官的损害,但针对高血压肾损伤的泛素化修饰研究还鲜有报道。发现调控HRD的新型E3泛素连接酶及探寻其调控机制,将为阐述HRD发病机制及研发HRD药物提供良好的理论基础,这也成为当前该领域的热点问题。TRIM（The tripartite motif）31属于TRIM家族的一员,也是一个非常重要的E3泛素连接酶,其是否同样在高血压及HRD中发挥重要作用尚未报道。既往研究表明,TRIM31在多种疾病发展中发挥着关键的调控作用,尤其是在肿瘤的增殖、迁移过程中,机制方面主要涉及到TRIM31调控核因子κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）的活化参与炎症反应。因NF-κB的活化在HRD的病理进展中发挥着至关重要的作用,提示TRIM31可能同样参与到HRD疾病的发生和发展中。在本实验中,我们提出以下科学假设:在AngⅡ构建的HRD小鼠模型中,E3泛素化连接酶TRIM31可改善肾脏功能、纤维化和炎症反应。为了验证以上假说,我们精心设计了一系列的体内和体外实验。研究目的1.探讨TRIM31与人和小鼠HRD病理进展的相关性;2.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏功能损害;3.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏纤维化;4.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏炎症反应。研究方法1.实验动物利用 TALEN（Transcription activator-like effectors Nucleases）技术构建TRIM31基因敲除（TRIM3 1-/-）小鼠,小鼠背景为C57BL/6J。与野生型C57BL/6J小鼠杂交扩繁,得到同窝纯合野生型C57BL/6J（TRIM31+/+）小鼠和TRIM31-/-小鼠。野生型C57BL/6J小鼠购买于维通利华（北京）实验动物技术有限公司。所有动物实验均遵循国家卫生部动物管理办法（documentation No 55,2001）,同时遵守山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。2.实验动物分组（1）选取8周龄雄性野生型（Wildtype,WT）C57BL/6J小鼠,随机分成两组,每组15只:生理盐水组,AngⅡ组。（2）分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRIM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组。3.HRD小鼠模型的建立预先将微量渗透泵灌注适当剂量AngⅡ分别埋入8周龄雄性小鼠的背侧皮下,以泵速1000ng/kg/min持续泵入AngⅡ 42天,构建高血压小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水（每组15只）。分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠24h尿液。实验结束时,将小鼠进行安乐死,测量体重及左右肾重,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本进行下一步组织和细胞分子学研究。4.临床高血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TRIM31蛋白的表达情况,同时利用苏木素-伊红染色（Hematoxylin andeosin,HE）和 Masson’s trichrome 染色探讨 TRIM31蛋白表达与肾脏损伤和纤维化程度的相关性。5.小鼠基因型鉴定利用鼠尾提取试剂盒提取小鼠鼠尾DNA,PCR扩增后通过测序对小鼠进行基因型鉴定。同时提取小鼠的肾脏组织蛋白,通过蛋白免疫印迹分析（Western blot）的方法检测TRIM31的蛋白表达水平,评估TRIM31的基因敲除效率。6.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）,培养在 10%FBS 的 RPMI1640 培养基中,于含 5%CO2 的 37℃孵箱中增殖。主要处理见下:（1）时间浓度实验:选用10-5MAngⅡ分别刺激HK2细胞0,4h,8h,12h,24h,36h,收集细胞。（2）浓度梯度实验:分别选用 0,10-8M,10-7M,10-6M,10-5M,10-4M的 AngⅡ刺激HK2细胞24h,收集细胞。7.小鼠血压测量利用Data Sciences International（DSI）无线遥感测量方法分别于造模前和造模后每周定时测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组）的收缩压（Systolic blood pressure,SBP）和舒张压（Diastolic blood pressure,DBP）。8.小鼠组织样本取材分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠尿液进行相关肾脏功能指标检测。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本,对心脏和左右肾脏进行称重,剥除肾脏包膜,依后期实验需求将各个组织放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定24-48h或者放于2%戊二醛中固定以待后续实验使用。9.小鼠肾脏功能和24h尿蛋白检测留取小鼠血液和尿液,利用全自动生化仪和ELISA的方法检测TRIM31-/-小鼠与 TRIM31+/+小鼠血清中尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（serum creatinine,Cr）、尿酸（Uric acid,UA）以及24h尿蛋白等主要肾脏功能指标的差异。10.透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察小鼠肾脏超微结构取4组小鼠的肾脏皮质,利用2.5%的戊二醛固定组织后,利用透射电镜观察4组小鼠的肾小球足突细胞、基底膜等超微结构。11.Meso Scale Discovery（MSD）检测血清中炎症相关指标取的4组小鼠冻存在-80℃冰箱的血清,基于电化学发光的原理,利用预包埋好的MSD多因子检测板和MSD检测器来检测小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的含量。12.小鼠肾脏组织学和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4μm）。通过Masson’s trichrome和天狼猩红染色检测4组小鼠肾脏间质的纤维化情况。过碘酸雪夫氏染色（Periodic acid-schiffstain,PAS）观察小鼠肾脏中肾小球硬化的差异。利用IHC的方法检测4组小鼠肾脏组织中TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、α-SMA、CD68、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达差异。13.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因trim31、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、fibronectin、α-sma、tnf-α、il-6和il-1β的 Ct 值,利用β-actin作为内参,将所得的Ct值,采用公式（2-ΔΔCT）计算目的分子表达量的的相对变化。14.Western blot 分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测TRIM31、TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、Δ-SMA、TNF-Δ、IL-6 和 IL-1β 的蛋白含量。15.数据统计分析方法所有数据分析均使用的GraphPad Prism 8软件,以均数（mean）±标准误（SEM）进行表示。首先采用Shaβ1ro-Wilk检验对数据分布进行正态性假设的评估。对于属于正态分布的单因素数据,两组间的统计差异采用非配对t检验分析,多组间的统计差异采用单因素方差分析。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。对于不属于正态分布的数据,我们使用的Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.在AngⅡ诱导的HRD小鼠模型肾组织中TRIM31的表达量明显下调我们通过在小鼠皮下埋入AngⅡ缓释泵成功构建了 HRD小鼠模型。通过IHC、Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠肾脏的TRIM31表达量明显下调。2.AngⅡ剂量和时间依赖性调控肾小管上皮细胞中TRIM31的表达体外培养的HK2细胞,AngⅡ刺激细胞不同的时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）或以不同的浓度（0,10-8 M,10-7M,10-6 M,10-5 M,10-4 M）的 AngⅡ刺激细胞,利用Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现伴随AngⅡ的梯度刺激,TRIM31的表达在蛋白水平和mRNA水平均呈现显着降低。以上体内外实验说明,TRIM31的表达与HRD存在一定相关性,提示我们TRIM31可能参与到HRD疾病进展过程。3.利用TRIM31敲基因小鼠构建AngⅡ诱导的小鼠HRD模型（1）在C57BL/6J的小鼠背景下,利用TALEN技术成功构建TRIM31敲基因小鼠。提取小鼠鼠尾基因组DNA进行鼠尾基因型鉴定,证实了 TRIM31敲基因小鼠成功构建。同时提取TRIM3 1+/+和TRIM3 1-/-小鼠肾脏组织蛋白,利用Western blot的技术进一步验证了 TRIM31敲基因小鼠中TRIM31的蛋白敲除效率。（2）测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM3 1-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM3 1-/-+AngⅡ组）造模前后的体重和取材后左右肾重量,发现TRIM31基因敲除并不影响小鼠的肾重/体重比。4.TRIM31基因缺失不影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变利用DSI遥感法对4组小鼠的SBP及DBP进行测量,结果显示,与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠血压在泵入后第一周起即出现明显升高,并在接下来的几周持续在较高水平。DSI测量结果显示AngⅡ组小鼠造模结束前最后一周血压均大于140mmHg,达到高血压的水平,证实了小鼠高血压模型构建成功。然而在泵入生理盐水或者AngⅡ后,TRIM31+/+与TRIM31-/-两组小鼠间无明显血压改变。以上结果说明,TRIM31基因缺失不影响小鼠血压的基线水平,也不影响影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变。5.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾功能损伤小鼠血清Cr、BUN和24h尿蛋白的测量表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠出现了肾功能的损伤和小鼠肾滤过屏障的损害,而TRIM31基因缺失进一步加重了AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾损伤。肾脏Nephrin、KIM-1的Western blot和IHC染色提示,TRIM31基因敲除加重了 AngⅡ引起HRD小鼠的肾小管的损伤和肾脏足突细胞的损害。同时PAS染色表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠的发生了肾小球硬化,TRIM31基因敲除进一步加重HRD小鼠的肾小球硬化。此外,TEM检测发现TRIM31基因敲除后明显加AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的足突和基底膜的损害。以上说明TRIM31基因缺失明显加重了 HRD小鼠的肾功能损伤。6.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化Masson’s trichrome和天狼猩红染色显示,AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾脏呈现明显的纤维化,并且TRIM31-/-小鼠较TRIM31+/+小鼠更严重。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、纤连蛋白（Fibronectin）和促纤维化因子 α-smooth muscle actin（α-SMA）的 IHC、Western blot、RT-PCR 实验显示在泵入 AngⅡ后,与TRIM31+/+对比,TRIM3 1-/小鼠的以上纤维化指标表达明显增加。提示TRIM31基因缺失可明显加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化。7.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的炎症反应利用MSD多因子检测技术检测4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM3 1+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组）血清中炎症相关指标,结果显示泵入AngⅡ后,小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-iβ的表达量明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-小鼠增加的更为显着。利用巨噬细胞表面Marker CD68抗体对4组小鼠肾脏进行IHC染色,结果显示泵入AngⅡ后,巨噬细胞浸润明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-进一步加重了HRD小鼠的肾脏组织中巨噬细胞的浸润。同时IHC、Western blot和RT-PCR的方法检测4组小鼠肾脏炎症指标表达量,结果同样提示与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31基因敲除后明显增强小鼠肾脏组织中炎症相关分子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达。8.TRIM31在HRD患者肾活检组织中的表达明显下降利用IHC的检测方法,我们发现与非高血压患者的正常癌旁肾组织Control和非高血压的GML活检肾组织相比,HRD患者的肾组织切片中TRIM31的表达量明显下调。实验结论1.TRIM31在HRD的病理组织中蛋白表达量降低。2.TRIM31基因缺失明显加重了小鼠高血压肾功能损害、纤维化和炎症反应。研究背景炎症和纤维化是高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）的两个主要病理特征,血管紧张素Ⅱ（AngiotensionⅡ AngⅡ）在诱发肾脏组织发生炎症和纤维化的过程中发挥着关键作用。转化生长因子β1（Transfoiming growth factor-beta 1,TGF-β1）是HRD炎症、纤维化发病机理中的主要调控因子。TGF-β1可诱导细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）的生成和沉积、促进成纤维细胞的增殖和分化和上皮细胞的转分化等病理过程。机制方面,TGF-β1主要通过介导Smad依赖的信号通路和非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB信号通路）的活化来调控肾脏纤维化及肾脏炎症,靶向抑制TGF-β1下游信号通路的激活对HRD的治疗具有重大意义。研究显示,Angll可诱导肾脏过度分泌TGF-β1等细胞因子,并进一步通过TGF-β1加重高血压肾损伤。探讨TGF-β1信号通路的调控机制,有利于进一步阐明高血压肾病的发病原因,并为高血压肾病药物研发提供理论依据。TGF-β-activated kinase 1（TAK1）是一种丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K）。TAK1的激酶活性受到TGF-β1等多种细胞因子的调控。研究显示,活化的TAK1进一步磷酸化TGF-β1信号通路下游关键接头蛋白,在非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB）的活化及炎症因子的产生过程中发挥着关键作用。然而,在HRD发生发展过程中,TAK1是否同时参与调控TGF-β1介导的经典Smad信号通路及肾脏纤维化进展仍有待进一步的研究阐明。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,是泛素本身通过7个内部的赖氨酸（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K64）形成多聚泛素链。E3泛素连接酶决定了泛素分子结合到靶蛋白的特异性,因此也是蛋白质泛素过程中最关键的分子。蛋白质泛素化修饰在多种疾病发生发展过程中发挥着关键作用。研究蛋白质泛素化修饰调控HRD发生的分子机制,并寻找新型治疗靶点具有重要的科学意义和临床价值。已有文献报道,蛋白泛素化修饰在TGF-β1下游信号转导以及TAK1生物学功能的发挥着重要的作用,然而相关的E3泛素连接酶有待进一步的发现。在我们第一部分研究中已证实The tripartite motif 31（TRM31）参与并调控HRD小鼠肾功能损伤、纤维化和炎症反应。TRIM31是否通过调控TGF-β1信号通路在HRD中发挥作用,以及具体的分子机制有待进一步研究。因此,我们在本研究中提出了以下科学假说:TRIM31可通过泛素化修饰TGF-β1信号通路中的靶蛋白,从而参与到TGF-1P相关信号通路在HRD中的激活,进而在HRD病理进程中发挥保护作用。在本研究中,我们将通过体内和体外实验研究进一步探讨TRIM31在HRD中发挥作用的分子机制,为高血压肾损害的治疗寻找新的靶点。研究目的1.探讨在HRD病理进展中TRIM31对TGF-β1信号通路活化的影响;2.探讨TGF-β1信号通路TRIM31的靶分子;3.探讨TRIM31对靶分子的泛素化修饰情况;4.探讨TAK1在TGF-β1信号通路中的作用。研究方法1.实验动物分组分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRJM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRJM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组。2.HRD小鼠模型的建立将预先灌注好AngⅡ的微量渗透泵,分别埋入小鼠的背侧皮下,按照以1000ng/kg/min的泵速持续泵入AngⅡ42天,构建HRD小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠肾脏进行下一步组织和细胞分子学研究。3.临床髙血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TGF-β1、Collagen Ⅰ、pSmad3、TAK1、TNF-a、pP65的表达情况。4.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）、小鼠原代肾小管上皮细胞（Mouse Primary renal tubular eβ1thelial cells,MRPTEβ1C）、人胚肾细胞（HEK-293T）,分别培养在含10%FBS的RPMI1640、高糖DMEM培养基和Eβ1CM-A培养基中,于含5%CO2的37°C孵箱中增殖。主要处理见下:（1）HK2细胞处理:1)选择hTGF-β1作为HRD体外刺激因子。体外培养HK2细胞,给予不同浓度的hTGF-β1（0,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL,8ng/mL,10ng/mL）刺激24h或以10ng/mL的hTGF-β1刺激不同时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）,收集细胞;2)体外培养HK2细胞,给予TGF-β1中和抗体预处理后,以10-5 M浓度的AngⅡ刺激HK2细胞时间梯度（0,4h,8h,12h,24h,36h）,提取细胞蛋白;3)体外培养HK2细胞,利用RNAiMAX转染细胞TRIM31的小干扰RNA敲减TRIM31的表达,使用10ng/mL的hTGF-β1刺激细胞0、12h或24h,提取细胞蛋白;4)将构建的将Flag标签的TRIM31-WT、缺失突变体TRIM31-ΔRing以及点突变TRIM31-C53A/C56A过表达质粒利用Lipo3000转染试剂分别转染体外培养的HK2细胞,并利用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0或24h,提取细胞蛋白,进行Western blot实验;5)体外培养HK2细胞,lOng/mLhTGF-β1刺激0.5h或lh后,提取细胞蛋白,进行Western blot或免疫共沉淀实验（Co-immunopreciβ1tation,Co-IP）实验;6)体外培养HK2细胞系,利用TAK1的特异性抑制剂5z-7-oxozeaenol（5z7）抑制TAK1的激酶活性,或利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mLhTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（2）MRPTEpiC细胞处理:体外培养MRPTEpiC细胞,利用TAK1的特异性抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性,或者利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（3）HEK-293T细胞处理:1)将TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4的过表达质粒,与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。提取细胞蛋白进行Co-IP实验;2)将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,进行细胞免疫荧光染色;3)将TRIM31不同的截断突变体（TRIM31-ΔRing,TRIM31-AB,TRIM31-AC-C,TRIM31-AC）和TAK1的不同截断突变体（l-300aa,l-480aa,30I-579aa）,分别与野生型TAK1或者野生型TRIM31过表达质粒共转染入HEK293T细胞系,提取细胞蛋白进行Co-IP实验;4)将不同浓度的Flag-TRIM31过表达质粒与相同浓度Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系,提取细胞蛋白;5)将Flag-TRIM31与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系后培养24h,提取细胞蛋白前4h分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂氯喹（chloroquine）,提取细胞蛋白;6)将Flag标签的TRIM31-WT、TRIM31-ARing以及TRM31-C53A/C56A与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白;7)将HA标签的不同类型（WT、K48或K63）泛素过表达质粒,与Flag-TRIM31、Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白,进行CO-1P实验;8)将TAK1赖氨酸点突变过表达质粒Myc-TAK1-K72R、Myc-TAK1-K158R,分别与Flag-TRIM31和HA标签的泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,24h后提取蛋白,进行CO-IP实验。5.小鼠组织样本取材造模结束后将小鼠进行安乐死,留取小鼠肾脏标本,剥除肾脏包膜后,分别放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定2448h以待后续实验使用。6.小鼠肾脏组织制备和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4pn）。利用IHC染色的方法检测4组小鼠肾脏组织中TGF-β1的表达差异。7.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因八Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、Jibronectin、a-sma、tnf-a、il-6和il-1β办的Ct值,利用P-actin作为内参,将所得的Ct值,采用2-AACT公式计算目的分子的相对表达量的变化。8.Western blot分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测各个目的分子的蛋白含量。9.激光共聚焦检测TRIM31与TAK1的共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测TRIM31与TAK1在细胞内的共定位情况。10.表达载体和点突变的构建通过目的基因的引物设计、扩增、酶切和连接等步骤进行重组质粒和点突变质粒的构建和抽提,用于进一步的过表达和体外转录翻译实验。11.免疫共沉淀魏（Co-IP）体外培养HK2,利用内源性抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外培养HEK293T细胞,并构建各种目的分子的过表达质粒转染细胞,利用标签抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外翻译系统表达目的分子蛋白,利用标签抗体进行Co-IP检测目的分子的外源性结合。12.细胞转染体外培养HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞,将TRIM31或TAK1的小干扰RNA利用RNAiMAX转染细胞,敲减目的基因的表达。将过表达质粒利用Lip3000转染细胞进行目的基因的过表达。13.体外翻译系统进行体外蛋白表达实验构建含有T7启动子的PCDNA3.1过表达质粒,利用Promega公司的TNT Quick Coupied Transcription/translation System试剂盒进行网织红细胞体外转录翻译系统,或者利用Mini Expression Module试剂盒进行大肠杆菌体外翻译对TAK1和TRIM31等表达质粒进行体外转录翻译。14.体外泛素化修饰实验将体外翻译系统获得的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素修饰系统（包含有El,UbcH5a,K48,K63等蛋白）,室温反应30分钟后,利用Western blot的方法检测体外泛素化修饰的情况及泛素化修饰的类型。15.数据统计分析方法所有数据使用GraphPad Prism 8软件进行分析,表示为均数（mean）土标准误（SEM）。采用Shapiro-Wilk检验进行数据分布的正态性假设的评估。采用非配对t检验分析正态分布的单因素数据中两组间的统计差异,采用单因素方差分析分析正态分布的的多组间的统计差异。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。不属于正态分布的数据,使用Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.TGF-β1参与了AngⅡ诱导的小鼠高血压肾损害TGF-β1是高血压肾损伤和肾小管间质纤维化的关键细胞因子。Western blot、IHC和RT-PCR检测发现,TGF-β1在AngⅡ诱导的小鼠HRD的肾脏组织中的表达量明显增加,说明TGF-β1参与了HRD的疾病进展。同时,TGF-β1的表达量在TRIM31+/+和TRIM31I小鼠之间没有统计学差异,说明TRIM31的基因敲除并不影响TGF-β1在HRD肾脏中的表达量。2.TGF-β1抑制TRIM31的蛋白表达Western blot及RT-PCR结果显示,伴随hTGF-β1刺激HK2细胞不同时间或利用不同浓度的hTGF-β1刺激细胞,肾小管上皮细胞中TRIM31的表达均呈现显着降低。这些结果说明TGF-β1抑制TRIM31基因的转录和翻译,并提示TRIM31可能参与TGF-β1介导的信号通路。而在给予TGF-β1中和抗体预处理的情况下,Angll导致TRIM31蛋白水平下降的情况得以恢复。以上提示TGF-β1负向调控TRIM31的蛋白表达,而Angn对TRIM31的蛋白表达调控可能是通过TGF-β1发挥的。3.TRIM31负调控hTGF-β1介导的肾小管上皮细胞的纤维化及炎症反应Western blot和RT-PCR检测结果显示,TRIM31基因敲减能明显加重hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化进程和炎症相关指标的表达。野生型TRIM31基因过表达可明显改善hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。而过表达缺失E3泛素连接酶活性的TRIM31 Ring结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及E3泛素连接酶活性缺失点突变过表达质粒TRIM31-C53A/C56A不影响hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。以上结果说明,TRIM31通过其E3泛素连接酶活性抑制hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症反应。4.TRIM31介导了TGF-β1信号的通路活化经典Smad信号通路以及非Smad信号通路在肾脏纤维化过程中发挥着重要作用,其中Smad2、Smad3的磷酸化代表经典Smad信号通路活化,ERK、JNK、P38、NF-κB的磷酸化代表非Smad信号通路的活化。提取4组小鼠(TRIM31+/+生理盐水组,TRIM31-/+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组)肾脏蛋白,Western blot检测显示,相比野生型小鼠HRD肾脏组织,TRIM31-/-HRD小鼠肾脏组织中Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-κB磷酸化明显升高。体外培养HK2细胞,发现TRIM31基因敲减同样能明显增强TGF-β1诱导的经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化水平。以上结果说明TRIM31可负向调控TGF-β1信号通路的活化水平。5.明确了TGF-β1信号通路中TRIM31的靶分蛋白前期结果表明TRIM31可调控TGF-β1介导的信号通路,我们将重点寻找该信号通路中TRIM31作用的靶蛋白。将TGF-β1信号通路中关键接头分子TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4等的过表达质粒与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。利用Co-IP实验检测发现TRIM31与TRAF6、TAK1发生了明显的结合。同时体外培养HK2细胞,hTGF-β1刺激不同时间点后,利用TRIM31特异性抗体进行Co-IP实验,同样检测到了内源性TRIM31与TAK1、TRAF6的结合,同时发现伴随着hTGF-β1刺激时间的增加,HK2细胞中TRIM31与TAK1的结合呈现增多的趋势。以上结果提示TAK1、TRAF6可能是TGF-β1信号通路中TRIM31调控的靶分子。6.TRIM31靶向降解TAK1将浓度梯度的TRIM31过表达质粒与TRAF6或TAK1过表达质粒分别共转染HEK293T细胞系,利用Western blot的方法检测到TRIM31可降低TAK1蛋白表达量,并且存在浓度梯度依赖性。然而,TRM31的过表达并不影响TRAF6的蛋白表达量。我们同时发现,转染TRIM31-ARing以及TRIM31-C53A/C56A过表达质粒不影响TAK1的蛋白表达量。以上结果说明,TRIM31可通过其E3泛素连接酶活性特异性降解TAK1,而对TRAF6的蛋白表达无影响。至此,我们确定TAK1为TGF-β1信号通路中TRIM31的结合及降解靶点。7.TRIM31对TAK1进行了蛋白酶体途径的降解泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径是体内蛋白质发生降解的主要途径。我们将Flag标签的TRIM31过表达质粒与Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,培养24h后分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂chloroquine处理4h,提取细胞蛋白,利用Western blot的方法检测到蛋白酶体抑制剂Bortezomib可恢复TRIM31介导的TAK1降解,而溶酶体抑制剂chloroquine对TRIM31介导的TAK1降解无影响。以上说明TRIM31通过蛋白酶体途径介导TAK1的降解。8.TRIM31与TAK1在细胞浆中共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测发现TRIM31与TAK1在细胞中存在明显的共定位。9.TRIM31与TAK1体外结合利用大肠杆菌和网织红细胞体外翻译系统分别获得TRIM31和TAK1的体外表达蛋白,利用glutathione S-transferase（GST）pull-down实验和Co-IP的方法检测到体外表达的TRIM31与TAK1蛋白可发生直接结合。10.TRIM31与TAK1发生结合的结构域通过构建一系列TRIM31与TAK1的关键结构域截断突变体,共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31的130-425氨基酸序列与TAK1的1-300氨基酸序列分别在TRIM31与TAK1的结合中发挥着重要作用。11.TRIM31对TAK1进行了泛素化修饰前期结果证明TRIM31介导了TAK1蛋白酶体途径的降解,TRIM31作为E3泛素连接酶家族的一员,我们进一步探索了TRIM31是否是通过泛素化修饰TAK1进而介导其发生蛋白酶体途径降解。将泛素过表达质粒、TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31明显促进了TAK1的泛素化修饰,过表达泛素连接酶活性关键结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及泛素连接酶活性缺失点突变体TRIM31-C53A/C56A则没有此作用,说明TRIM31可促进TAK1的泛素化修饰,这一作用与TRIM31的E3泛素连接酶功能密切相关。作为对照,TRM31并不能促进接头分子TRAF6的泛素化修饰。12.证明TRIM31促进TAK1进行了K48位泛素化修饰前面验证了TRIM31可对TAK1进行泛素化修饰,为进一步探索TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的类型,我们分别将不同类型（WT、K48或K63）的泛素过表达质粒,与TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,泛素化实验表明TRIM31可明显促进TAK1 K48位的泛素化修饰。同时培养HK2细胞系,利用TRIM31小干扰RNA敲减TRIM31的表达,hTGF-β1刺激后,提取细胞蛋白,利用TAK1特异性抗体进行Co-IP,结果显示TRIM31同样可介导内源性TAK1蛋白的K48位的泛素化修饰。13.发现了TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的具体位点为了进一步探索TRIM31对TAK1上哪个赖氨酸位点进行了泛素化修饰,我们通过查阅文献发现TAK1上第158位赖氨酸位点和第72位赖氨酸位点可能发生泛素化修饰,但调控这2个位点进行修饰的E3泛素连接酶却一直没有被发现。我们进一步构建了K158位和K72位赖氨酸突变的TAK1过表达质粒,分别与TRIM31过表达质粒和K48泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,通过泛素化实验检测发现TRIM31可对TAK1第72位赖氨酸进行了K48位的泛素化修饰。14.利用体外蛋白拥译系统和体外泛素化系统验证了TRIM31对TAK1的泛素化修饰为了进一步探索TRIM31是否直接对TAK1进行泛素化修饰,我们将TAK1和TRIM31分别构建到含有T7启动子的PCDNA3.1-Myc过表达质粒上和含有T7启动子的PCDNA3.1-Flag过表达质粒上,然后利用Promega公司的TNT体外转录翻译系统对TAK1和TRIM31的表达质粒进行体外转录翻译,将翻译后的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素化修饰系统,利用Western blot的方法进一步证明了TRM31对TAK1进行了K48位的泛素化修饰。同时构建只保留K72位赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72）和只突变掉K72赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72R）的TAK1的点突变过表达质粒,并进行体外转录翻译得到Myc-TAKl、Myc-TAK1-K72、Myc-TAK1-K72R、FIag-TRIM31的蛋白,然后加入体外泛素化修饰系统,同样发现TRIM31只对含有K72位赖氨酸残基的TAK1进行泛素化修饰。以上结果共同说明了TRIM31可直接对TAK1的第72位赖氨酸进行K48位的泛素化修饰。15.TAK1介导了TGF-β1信号通路的活化体外培养HK2细胞系以及小鼠原代肾小管上皮细胞MRPTEβ1C,利用TAK1的抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性或者利用Si-RNA敲减TAK1的表达后,hTGF-β1介导的Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-kB磷酸化表达水平均明显下降。以上说明,在肾小管上皮细胞中,TAK1同时参与调控TGF-P1信号通路中经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化。16.临床患者TAK1、炎症、纤维化和TGF-β1信号通路与HRD的相关性从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁组织、无高血压的GML患者肾活检组织、HRD患者肾活检组织切片,并进行IHC检测。结果发现纤维化水平代表性指标Collagen Ⅰ、炎症水平代表性指标TNF-α、TGF-β1信号通路活化代表指标（TGF-β1、pSmad3、pP65）、以及TAK1的表达在HRD活检组织样本中明显增加。这些结果进一步提示我们,TAK1在HRD肾脏纤维化、炎症反应及疾病进展中可能发挥着重要作用。同时,伴随HRD疾病进展,TRIM31表达逐渐降低可能是导致TAK1表达升高及HRD疾病加重的重要原因。实验结论1.TRIM31参与了TGF-β1介导的肾脏纤维化和炎症反应;2.TRIM31通过靶向调控TAK1 K48位的泛素化修饰和蛋白酶体途径的降解进而负调控TGF-β1下游经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化,最终改善高血压肾损害。
沈双[7]（2021）在《基于“孙络-玄府”理论论治糖尿病肾病及通心络干预研究》文中研究表明糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）最主要的微血管并发症之一,是一种以持续性蛋白尿和肾功能进行性下降为特征的临床综合征,亦是引起慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）和终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）的最常见原因。中医古籍中并无关于DKD独立病名记载,多在消渴病中依据其病机、症状描述为“肾消”“消肾”“水肿”“尿浊”“关格”等。认为本病乃消渴病日久,五脏所伤,穷必及肾的结果。中医学认为“久病入络”,肾脏作为络脉聚集之所,其病变往往表现为肾络结构及功能的异常,故DKD属肾络病变。通心络是在络病学说指导下研制的复方中成药,其“搜、剔、疏、通”的特点使其广泛应用于脉络病变中,前期通心络对于DKD的研究多集中在“孙络-微血管”及肾小球病变。“孙络-玄府”作为络脉“行血气而营阴阳”的最小功能结构载体,暂无从“孙络-玄府”角度论治DKD的研究。因此,本课题从气络学说“孙络-玄府”理论论治DKD以及以肾小管损伤为重点研究本病发病机制具有新的意义。目的:本研究从气络学说“孙络-玄府”角度阐释DKD病机,给“通玄畅络”代表中药复方通心络治疗该病提供新的理论依据。实验部分通过DKD早期动物模型db/db小鼠和高糖高脂诱导的近曲肾小管上皮细胞（HK-2）损伤模型,观察通心络对DKD小鼠肾脏及对高糖高脂诱导的肾小管上皮细胞的保护作用,完善通心络治疗DKD的实验证据,为中医学异病同治思想与中药复方多靶点优势的一致性提供依据。方法:1.理论探讨:本研究理论部分首先对DKD中医病名、病因病机、治则治法方药进行系统梳理。其次将从气络学说“孙络-玄府”理论阐述DKD病机及在此指导下的治疗用药特点。2.实验研究:实验一:选取6周龄SPF级雄性C57BL/Ks小鼠和雄性C57BL/Ks-LepRdb/LepRdb db/db小鼠,适应性喂养2周后,根据体重将db/db小鼠随机分3组,即db/db组（模型组）、db/db+TXL组（通心络治疗组 0.75 g·kg-1d-1）、db/db+Met 组（二甲双胍治疗组 0.2 g·kg-1d-1）。动物分组后即开始灌胃给药,每日1次,每次给予实验小鼠药物处理前,均用电子天平称量小鼠体重,每只小鼠按照0.2mL/10g体重的体积进行灌胃,连续给药12周。C57BL/Ks正常组小鼠和db/db模型组小鼠均予等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。从给药0周起,每4周用小鼠代谢笼收集24小时尿液后记录尿量,离心留取上清液,全自动生化分析仪检测尿微量白蛋白及尿肌酐水平。在给药12周实验结束时,小鼠麻醉后处死,收集血液标本,检测各组小鼠血清中血糖（GLU）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、总蛋白（TP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）含量。打开小鼠腹腔,摘取双侧肾脏,用于后续苏木素-伊红染色（HE染色）、过碘酸-雪夫染色（PAS）染色和Tunel检测以及蛋白印迹实验（WB）。实验二:体外培养人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）,首先将细胞分为8组,低糖组（5 mmol/LD-Glucose,LG）、高糖组（25 mmol/L D-Glucose,HG）、高糖等渗组（5 mmol/L D-Glucose+20 mmol/L D-Mannitol,LGM）、低糖低脂组（5 mmol/L D-Glucose+300 μmmol/L palmitic acid,LGLP）、高糖低脂组（25 mmol/L D-Glucose+300 μmmol/L palmitic acid,HGLP）、低糖高脂组（5 mmol/L D-Glucose+500 μmmol/L palmitic acid,LGHP）、高糖高脂组（25 mmol/L D-Glucose+500 μmmol/L palmitic acid,HGHP）、溶剂对照组（Solvent control）,用MTS检测法观察不同浓度葡萄糖和棕榈酸对HK-2细胞活性的影响,进而确定造模条件。随后用MTS检测法观察不同浓度通心络对糖脂损伤下HK-2细胞的保护作用,确定通心络最佳给药浓度。最后,运用蛋白印迹实验（WB）,观察通心络对糖脂损伤下HK-2程序性细胞死亡不同模式（细胞凋亡、细胞坏死性凋亡、细胞焦亡、细胞铁坏死）的影响,以明确通心络的治疗靶点。实验三:根据实验二确定的通心络作用靶点,运用蛋白印迹实验（WB）,去实验一留存的小鼠肾脏组织去验证靶点。结果:1.理论研究:DKD属消渴病肾病范畴,病位在肾,传统中医认为该病脾肾亏虚为本,涉及心肝肺;燥热、痰瘀、浊毒为标。治疗上,古代辨证论治,重视脾肾,兼顾化瘀;现代倡导分期结合分型论治。尽管对DKD中医病名、病因病机、治则治法方药积累了较为丰富的论述,但DKD病情复杂,虚实交错,缠绵难愈的特点使其在治疗上仍十分棘手。吴以岭院士系统构建络病证治体系,形成气络学说、脉络学说两大学科分支,指出络脉呈现出由经入络、由气及血、由功能性病变发展为器质性病变的慢性病理过程,多有病程较长、疼痛反复发作、迁延难愈的特点。久病入络,久病及肾,显然DKD属于络病研究范畴。肾络迂曲细窄,消渴病日久,燥热、痰瘀、浊毒等侵袭肾络,则易滞易瘀、易积成形,引起肾络损伤,发为消渴病肾病。吴以岭院士率先开启以络论治DKD的研究,认为气阴两虚是DKD的发病基础,络脉瘀阻、津凝痰聚是DKD的主要病理环节,络息成积是DKD的主要病理变化。既往对于DKD的研究多集中从脉络学说微血管病变阐述其病机,本研究从气络学说“孙络-玄府”角度进一步阐释DKD病机及中医药治疗思路。“孙络-玄府”概念的提出,完善了中医藏象系统的结构层系,揭示了运行于孙络中的气血通过玄府有度的开阖与脏腑组织细胞进行物质能量交换与信息传递。无论是从广义上肾小球滤过（开）和肾小管重吸收（阖）功能来看与“孙络-玄府”开阖有度特征的相似性,还是狭义上探讨肾小球滤过屏障有选择的滤过和肾小管上皮细胞受系统调节的分泌功能、离子通道等和“孙络-玄府”结构、功能上的相似性,都提示肾之“孙络-玄府”损伤,开阖失度,是DKD特征。确立“通玄畅络”治法,注重肾乃封藏之本,补虚以助通利肾络,在固护肾中精血津液基础上配以开通玄府郁滞之药,并且注意调节脏腑气机升降出入,总不离“通”、“补”法,以恢复肾之“孙络-玄府”的结构和开阖功能。“通玄畅络”代表药物通心络可以改善DKD发展过程中由于“孙络-玄府”郁滞而致开阖失司导致水谷精微不循其道,下漏而为尿浊（蛋白尿）的症状。2.实验研究:实验一:本部分实验结果证实,db/db小鼠（BKS背景）是良好的DKD早期动物模型,TXL能够减少db/db小鼠24小时尿白蛋白排泄率,降低尿白蛋白尿肌酐比值、改善肾脏形态学异常（减少肾小管上皮细胞空泡变及轻微系膜增生）、减少肾脏Col Ⅰ和Col Ⅳ的表达,抑制肾脏肾小管上皮细胞DNA碎片化。实验二:体外实验发现单纯高糖（25 mmol/L D-Glucose,HG）对HK-2细胞生存活性无影响,当高糖叠加高脂（25 mmol/L D-Glucose+500 μmmol/L palmitic acid,HGHP）时,细胞活性显着降低（p<0.05）。单纯高糖及高糖叠加高脂培养下,HK-2凋亡相关蛋白pro caspase-3,cleaved caspase-3,Bax（促凋亡因子）的蛋白表达均显着升高（p<0.05）,Bcl-2（抑制凋亡因子）和Bcl-2/Bax 比值均显着降低（p<0.05）。这提示HG和HGHP均诱导HK-2细胞凋亡。单纯高糖干预组caspase-1、cleaved GSDMD、IL-1β蛋白表达显着升高,与NC组比较有统计学差异（p<0.05）,但其他焦亡相关蛋白表达与NC组相比无差异。高糖叠加高脂组,细胞焦亡相关蛋白NF-κB p-p65、NLRP3、ASC、pro caspase-1、cleaved caspase-1、cleaved GSDMD和IL-1β的表达均显着升高（p<0.05）,这提示高糖高脂诱导HK-2细胞焦亡。TXL能够抑制这些蛋白表达的改变,与HGHP组比较有统计学差异（p<0.05）。虽然HG、HGHP干预下,细胞坏死性凋亡相关蛋白MLKL、RIP3和细胞铁坏死相关蛋白GPX-4、FACL-4的表达有一些改变,但与NC组相比,无统计学差异。实验三:蛋白印迹实验（WB）结果表明,模型组db/db小鼠肾脏pro caspase-3、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达均上调,Bcl-2/Bax降低,与C57BL/Ks正常组小鼠相比,有统计学差异（p<0.05）,说明细胞凋亡激活。TXL治疗组db/db小鼠肾脏pro caspase-3、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达下降,Bcl-2/Bax增加,与模型组db/db小鼠相比,有统计学差异（p<0.05）,这提示细胞凋亡明显受到抑制。模型组db/db小鼠肾脏NF-κB p-p65、NLRP3、pro caspase-1,cleaved caspase-1 和 IL-1β 蛋白表达上调,与正常组相比,有统计学差异（p<0.05）,说明细胞焦亡激活。TXL治疗组db/db小鼠肾脏NF-κB p-p65、NLRP3、pro caspase-1,cleaved caspase-1 和 IL-1 β 蛋白表达下降,与模型组 db/db 小鼠相比,有统计学差异（p<0.05）,这提示细胞焦亡明显受到抑制。TXL干预可以抑制db/db小鼠肾脏组织细胞凋亡和细胞焦亡。结论:1.DKD属肾络病变,其病理变化与肾之“孙络-玄府”因郁滞开阖失司、津凝痰聚、络息成积的病理变化相一致。确立“通玄畅络”治法,以通为用、通补结合、通玄固玄需分辨。通心络全方补气通络、剔除络瘀、辛以通玄、搜风畅络,共奏通补之功,标本兼顾,切中DKD病机。2.通心络可以显着减少DKD早期动物模型db/db小鼠尿白蛋白排泄,改善肾脏形态学改变,保护肾功能,其作用与其抑制肾小管上皮细胞凋亡和焦亡有关,主要通过抑制NF-κB p65磷酸化,抑制NLRP3炎症小体相关蛋白表达,从而减少炎症因子IL-1β释放,抑制细胞焦亡。此外,通心络可以抑制促凋亡相关因子Bax以及凋亡执行分子Caspase-3的活化,增加抗凋亡相关因子Bcl-2的表达,从而抑制细胞凋亡。
王滕滕[8]（2021）在《白藜芦醇抑制肾草酸钙结石形成及其机制的研究》文中研究表明研究背景与研究目的肾结石是泌尿外科最常见的病种之一,国内的患病率和复发率均较高。庞大的患病人群已成为一个明显的社会和医疗负担,对临床和科研工作者更是一个严峻的挑战。在既往的研究中,我们通过分析互联网大数据,了解到大众对肾结石疾病的认知状况和健康需求,其中肾结石的药物预防和治疗是大众关注的一大热点。因而,如何更好的通过药物防治肾结石,是目前医学研究亟待解决的问题。当前,对于肾结石的研究面临许多的问题,其中之一是缺乏精确的分析手段。超级计算机和相应计算软件的发展为研究原子和分子之间的相互作用提供了新的途径。与传统的生物实验相比,计算机上进行的计算和模拟可以实现在更微观水平上进行药物作用机制的研究,同时结果的精准度和可靠性都令人满意。基于此,本研究第一部分,将利用量子力学中的第一性原理,研究钙原子（Ca）在白藜芦醇分子（C14H12O3）表面的吸附位置、吸附方式、吸附能量等基础问题,力图从微观结构上阐明白藜芦醇抑制草酸钙结石形成的机制,为以白藜芦醇为基础的药物研发提供思路和依据。网络药理学借助实验数据或文献、数据库,可模拟构建机体内的分子关联网络模型,探寻药物的生物学靶点和分子机制提供了一种新型手段。目前国内外尚无白藜芦醇（Resveratrol,RSV）防治草酸钙肾结石的系统研究,仅有的几个体外实验初步表明RSV具有抑制结石形成的潜能,然而其生物机制尚不明确。本研究第二部分,将利用网络药理学的方法,筛选出RSV抗肾结石的潜在作用靶点,并对其生物过程及作用通路进行预测,力图为进一步的生物实验提供理论支持和指导。单一的计算模拟分析结果可能会与药物在机体内的实际作用状况有偏差,因此,系统的细胞及动物水平的实验验证是有必要的,这又为计算模拟的预测结果提供可靠的证据。在本研究第三、四部分中,我们将以此前两部分研究为基础,重点做RSV防治肾草酸钙结石的细胞及动物研究。研究表明,过饱和的草酸钙晶体可诱发肾脏出现氧化应激损伤,导致肾小管上皮细胞的胞膜结构和功能发生改变,进而促进晶体的粘附和聚集,而晶体的粘附会不断刺激肾脏,反馈生成更多的活性氧,形成一个恶性循环,最终导致结石的生长。因而,肾脏的氧化应激损伤被认为是结石形成的重要机制,而抑制草酸钙晶体引起的肾脏损伤将有利于预防肾结石的形成。通过前两部分研究,我们对RSV防治肾结石的作用机制进行了预测,发现RSV可能通过多条通路抑制结石的形成,其中SIRT1/FOXO3a通路介导的肾脏氧化应激反应可能在其中发挥重要作用。既往研究发现RSV可以激活沉默信息调节因子1（SIRT1）,促使其与叉头框蛋白O3a（FOXO3a）结合,从而调节其转录活性,进而缓解过氧化氢、高糖等诱导的肾脏氧化应激损伤。据此,我们提出以下假说,草酸钙晶体可以抑制SIRT1的表达,而SIRT1的减少可以诱导乙酰化FOXO3a的表达增加,进而引发一系列氧化应激反应。RSV通过激活SIRT1,增强其脱乙酰化活性而调节FOXO3a的转录活性,促使抗氧化酶的生成,清除活性氧（ROS）,从而抑制由草酸钙晶体诱发的肾小管上皮细胞氧化应激反应,发挥其抑制结石形成的作用。目前,国内外尚无相关的系统研究。本研究将通过体外和体内生物实验,力图为RSV防治肾草酸钙结石提供有价值的实验依据。研究方法1.基于第一性原理的白藜芦醇对钙的吸附性能研究本实验采用密度泛函理论为第一性原理计算方法,VASP软件包,计算了白藜芦醇（C14H12O3）、草酸（C2H2O4）对钙的吸附作用性能。其中选择广义梯度近似（GGA）下的PBE泛函计算交换关联相互作用,赝势描述方法为投影缀加平面波（PAW）。K点划分为5×5×1,平面波截断动能为500 eV。结构优化阶段采取共轭梯度算法,收敛标准为两个离子步之间总能量差小于0.0001 eV,同时用DFT-D3 Grime方法对其相互作用进行了矫正。吸附过程中电荷转移量以Bader电荷进行分析。Ca在分子表面的吸附能为Eads,定义公式为:Eads=Esub+Ca-Esub-ECa计算得到的Eads若为负值,表面二者作用时发生放热反应,负值越大,吸附结构越稳定。计算平台由山东大学超级计算中心集群系统提供。1.1 Ca吸附于C14H12O3表面的吸附能分析首先获取白藜芦醇的分子结构式,利用计算机完成对C14H12O3的结构优化,获取其能量最稳定的分子优势构象。根据白藜芦醇的分子结构,选取5个位点作为计算C14H1203吸附Ca的初始位置,计算其吸附能并进行比较。1.2吸附体系的稳定构象为了进一步验证吸附体系的稳定性,我们将计算并描述吸附Ca后,C14H1203结构的变化。1.3 Ca吸附于C14H1203体系的电子结构绘制电荷密度差分图,可直观地显示Ca吸附前后,吸附体系的电荷密度重新分布状况。1.4 Ca吸附于C14H1203与草酸（C2H2O4）上的吸附能比较通过构建稳定的吸附体系并计算吸附能,对比C14H12O3与C2H2O4对Ca的吸附作用。2.基于网络药理学的白藜芦醇防治肾结石的作用机制研究2.1获取白藜芦醇的化学结构及分子、药理特性在PubChem数据库中检索关键词“resveratrol”,获取白藜芦醇的2D及3D结构图。利用TCMSP数据库,检索获取白藜芦醇的分子及药理学特征数据。2.2预测白藜芦醇的潜在作用靶点于 PharmMapper、TCMSP、TCM@TAIWAN、CTD、ETCM 等数据库平台分别检索并结合文献,剔除重复数据,整合后获取白藜芦醇的潜在作用靶点。2.3筛选肾结石疾病相关的靶点于GeneCards、DisGeNE、OMIM等数据库平台分别检索关键词“nephrolithiasis”、“kidney stone”,并查找文献,剔除重复数据,整合后获取获取肾结石疾病相关的靶点。2.4筛选白藜芦醇防治肾结石的潜在作用靶点绘制韦恩图,获取药物与疾病相关作用靶点的交集,即白藜芦醇防治肾结石的潜在作用靶点。2.5构建白藜芦醇抗肾结石的靶点蛋白质互作网络利用STRING 11.0网络平台,输入获取的交集靶点信息,靶点来源中选项设定为人类,自定义互作阈值为0.9,隐藏离散节点,生成蛋白质互作网络图。2.6蛋白质互作网络的拓扑分析利用可视化软件Cytospace,构建“药物-靶点-疾病”作用网络,同时借助其网络分析功能和MCODE插件,筛选出互作网络中的关键靶点和核心模块。2.7功能富集分析利用Metascape及Omicshare平台,将获取的白藜芦醇防治肾结石的潜在作用靶点进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因和基因组数据库（KEGG）通路富集分析,并将结果进行可视化。2.8白藜芦醇与核心靶点的分子对接验证进行分子对接实验时,先于PDB数据库检索获取核心靶点对应的蛋白结构,然后利用Pymol软件及AutoDock Vina软件,模拟分析白藜芦醇与靶点蛋白的结合方式,计算其亲和能。3.白藜芦醇体外对草酸钙结石晶体粘附的影响3.1激光共聚焦显微镜下观测体外培养肾小管上皮细胞（HK-2）,实验分四组:第1组:空白对照组;第2组:CaOx处理组;第3组:CaOx+低浓度白藜芦醇组（40μM）;第4组:CaOx+高浓度白藜芦醇组（80μM）。染色后,激光共聚焦显微镜下观测细胞形态及晶体粘附状况。3.2细胞活力检测细胞培养、分组、建模方法同步骤1,当达到作用时间后,加入CCK8试剂,在450 nm处测量吸光度。3.3透明质酸的检测应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）分组检测各组透明质酸（HA）的含量。3.4乳酸脱氢酶（LDH）的检测应用分光光度计分组检测各组乳酸脱氢酶的释放量。4.白藜芦醇通过调节SIRT1/FOX03a抑制草酸钙结石诱发的肾脏氧化应激损伤4.1白藜芦醇对草酸钙晶体刺激的肾小管上皮细胞中氧化应激指标（SOD、MDA、ROS、CAT）、骨桥蛋白（OPN）、肾损伤分子1（KIM-1）及SIRT1表达的影响（1）细胞模型的构建使用67μg/cm2草酸钙（CaOx）结晶对HK-2细胞连续刺激24小时。建模前1小时给予不同浓度的白藜芦醇（40,80μM）,当CaOx与HK-2相互作用24h后,对细胞及培养液进行收集。实验分为4组:空白对照组;CaOx处理组;CaOx+低浓度白藜芦醇组（40μM）;CaOx+高浓度白藜芦醇组（80μM）。（2）用分光光度计分别检测HK-2细胞中氧化应激指标超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量及活性氧（ROS）含量,SIRT1的脱乙酰化活性;Western blot检测SIRT1、FOXO3a、过氧化氢酶（CAT）表达水平;免疫共沉淀检测乙酰化FOXO3a的蛋白水平。（3）用Western blot和荧光定量PCR测定OPN、KIM-1的蛋白及基因水平。4.2 SIRT1对草酸钙晶体刺激的肾小管上皮细胞中氧化应激指标的影响（1）分组与处理:体外培养肾小管上皮细胞,分别用SIRT1 siRNA和CON siRNA转染。实验分为4组:CaOx+转染CON siRNA组;CaOx+转染CON siRNA+RSV 处理组;CaOx+转染 SIRT1 siRNA;CaOx+转染 SIRT1 siRNA+RSV处理组。（2）用分光光度计分别检测HK-2细胞中SOD活性、MDA含量及ROS含量;Western blot检测SIRT1、FOXO3a、CAT蛋白表达水平;免疫共沉淀检测乙酰化FOXO3a的蛋白水平。（3）用Western blot和荧光定量PCR测定OPN、KIM-1的蛋白及基因水平。4.3白藜芦醇对大鼠草酸钙结石动物模型代谢指标、结晶沉积及肾组织病理的影响（1）24只Wistar大鼠随机分为3组分别处理:空白对照组（自由采食、饮水+0.9%生理盐水灌胃）,造模组（自由采食+1%乙二醇自由饮水+0.9%生理盐水灌胃）;白藜芦醇干预组（自由采食+1%乙二醇自由饮水+1Omg/kg/dRSV灌胃）。（2）大鼠标本的留取:处死前1天,用代谢笼法分别收集大鼠24h尿液。麻醉后,心脏内取血。解剖肾脏,完成HE染色及蛋白免疫组化染色。（3）肾脏功能及尿液生化检测:临床生化分析仪测定血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）,尿（钙、磷、钾）;比色法测定尿草酸含量。（4）HE染色后观察肾脏的结晶沉积和病理改变。4.4白藜芦醇对大鼠草酸钙结石动物模型肾脏氧化应激指标、OPN、KIM-1及SIRT1表达的影响（1）采用Western blot方法以及免疫沉淀的方法分别检测各组大鼠肾脏中SIRT1、FOXO3a、CAT及乙酰化FOXO3a的表达,并用分光光度计检测SOD活性,MDA含量及SIRT1的脱乙酰活性;（2）用免疫组织化学染色、Western blot和荧光定量PCR测定OPN、KIM-1的蛋白及基因水平。研究结果1.基于第一性原理的白藜芦醇对钙的吸附性能研究1.1 Ca吸附于C14H1203上的吸附能分析首先获取白藜芦醇的结构式,完成对C14H12O3的结构优化,获取了其能量最稳定的优势分子构象。根据白藜芦醇的分子结构,选取了 5个位点作为计算C14H12O3吸附Ca的初始位置。5个原始构型分别为:（a）Ca位于3,5-羟基苯环中央正上方;（b）Ca位于3-羟基的氧原子正上方;（c）Ca位于5-羟基的氧原子正上方;（d）Ca位于4’-羟基的氧原子正上方;（e）Ca位于4’-羟基苯环中央正上方。计算结果显示在所有的原始构型中,其吸附能均为负值。在五个初始位点中,构型（a）的吸附能最小,为-0.874 eV,吸附距离为2.39A。1.2吸附体系的稳定构象吸附Ca之后,C14H1203的结构发生驰豫,其侧视图和俯视图直观地显示了Ca的吸附对C14H1203几何结构的影响。1.3 Ca吸附于C14H12O3体系的电子结构吸附时,Ca和C14H1203的碳原子之间存在着电荷聚集,同时Ca背向C14H1203的另一侧存在电荷数目的减少,这表明在吸附过程存在着Ca向C14H12O3的电子转移。进一步的Bader电荷分析表明,吸附过程中有0.855 e-电荷从Ca转移到了C14H12O3,这就是Ca在C14H12O3表面吸附成键的主要特征。1.4 Ca吸附于C14H1203与C2H2O4上的吸附能比较成功构建了草酸（C2H2O4）吸附Ca的稳定构象,计算吸附体系的吸附能为-0.68 eV,大于Ca/C14H1203体系的-0.874 eV,提示C14H1203可竞争性抑制草酸钙的生成。2.基于网络药理学的白藜芦醇防治肾结石的作用机制研究2.1获取白藜芦醇的化学结构及分子、药理特性获取了白藜芦醇的12个主要分子及药理学特征数据,涵盖药物的分子量（228.26D）、生物利用度（19.07%）及类药性（0.11）等指标。2.2预测白藜芦醇的潜在作用靶点于 PharmMapper、TCMSP、TCM@TAIWAN、CTD、ETCM 等数据库平台分别检索并结合文献,剔除重复数据,整合后共获取白藜芦醇的潜在作用靶点421 个。2.3筛选肾结石疾病相关的靶点分别于 GeneCards、DisGeNE、OMIM 等数据库检索关键词“nephrolithiasis”、“kidney stone”,并结合文献,剔除重复数据,整合后共获取获取肾结石疾病相关的靶点1434个。2.4筛选白藜芦醇防治肾结石的潜在作用靶点将白藜芦醇潜在作用靶点与肾结石疾病相关靶点进行交集映射,共获取白藜芦醇防治肾结石的潜在靶点115个,结果以韦恩图的形式呈现。2.5构建白藜芦醇抗肾结石的靶点蛋白质互作网络蛋白质互作网络（PPI）网络包括115个作用节点,1601条作用通路,平均的节点度为27.8。2.6蛋白质互作网络的拓扑分析依据标准,利用Cytoscape的网络分析功能,筛选出了白藜芦醇抗肾结石PPI互作网络中的关键靶点,共9个,分别为:AKT1、CAT、FOXO3a（或FOXO3）、JUN、MAPK1、SIRT1、SOD1、T53、VEGFA。进一步利用 Cytoscape 的 MCODE插件,在网络中共筛选出了 3个核心模块。2.7 GO及KEGG功能富集分析GO功能富集分析结果显示,富集于生物过程（BP）的条目共有5025个,涉及细胞过程、代谢进程、生物调节、应激反应、生物过程调节等;富集于细胞成分（CC）的条目共412个,涉及细胞器、生物膜内环境、蛋白复合体、细胞外区域、突触等;富集于分子功能（MF）的条目共575个,涉及催化活性、分子功能调节器、抗氧化活性、分子换能器活性、转运体活性等。这些功能通路多与机体内的氧化应激、炎症、代谢、损伤修复等进程密切相关,提示白藜芦醇可能通过调控上述生物进程而发挥其防治肾结石的潜能。KEGG通路富集分析结果表明,富集的信号通路共233条,靶点主要富集于氧化应激、凋亡、炎症、细胞周期的调控等多方面,结合文献分析,这些靶点与SIRT1/FOXO3a信号通路密切相关,提示白藜芦醇可能是通过调控SIRT1/FOXO3a通路介导的肾脏氧化应激反应而发挥防治肾结石的作用。2.8白藜芦醇与核心靶点的分子对接验证AKT1与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Gly159、Gly157、Glu191与RSV形成氢键相互作用,Asp292、Lys179、Va1164、Lys158、Lys163、Gly162、Phe161、Ile186、His194、Thr195 与 RSV 形成疏水相互作用,亲和能为-7.9 kcal/mol。CAT与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Ala133、Arg112、Arg365、Thr361与RSV形成氢键相互作用,His362、Arg72、Ser114、Phe132、Gly131、Gly147、Va1146、His75、Tyr358、Va173 与 RSV 形成疏水相互作用,亲和能为-9.0 kcal/mol。FOXO3a与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Gly198、Leu180、Ser200与RSV形成氢键相互作用,Ser181、Tyr184、Asp199、Ala204、Lys207 与 RSV 形成疏水相互作用,亲和能为-5.6 kcal/mol。JUN与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Asn17与RSV形成氢键相互作用,Tyr18、Ala15、Lys14与RSV形成疏水相互作用,亲和能为-4.9kcal/mol。MAPK1与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Met108、Asp167、Asn154、Lys54 与 RSV 形成氢键相互作用,Cys166、Leu156、Leu107、Asp106、Ala52、Gln105、Va139 与 RSV 形成疏水相互作用,亲和能为-7.2 kcal/mol。SIRT1与RSV的结合模式:氨基酸残基Lys304与RSV形成氢键相互作用,Glu300、Glu214、Asp298、Pro212、Ala295、Tyr301、Asp289、Pro291、Asp292与RSV形成疏水相互作用,亲和能为-7.5 kcal/mol。SOD1与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Lys23与RSV形成氢键相互作用,Gly33、Va129、Trp32与RSV形成疏水相互作用,亲和能为-5.2 kcal/mol。TP53与RSV之间的结合模式:氨基酸残基Leu330、Leu348与RSV形成氢键相互作用,Asn345、Phe338、Phe341、Arg342、Arg344与RSV形成疏水相互作用,亲和能为-6.1 kcal/mol。VEGFA与RSV 的结合模式:氨基酸残基 Tyr45、Ile43、Glu44、Glu42、Phe36、Pro40 与RSV形成疏水相互作用,亲和能为-5.4 kcal/mol。3.白藜芦醇体外对草酸钙结石晶体粘附的影响3.1激光共聚焦显微镜下观察结果镜下观察,白藜芦醇可修复肾小管上皮细胞形态,减少草酸钙结石晶体在细胞表面的粘附。3.2细胞活力检测白藜芦醇可以减轻CaOx晶体对HK-2细胞的毒性作用,细胞活力出现显着升高（P<0.05）,显示白藜芦醇具有抑制细胞凋亡或坏死的作用。3.3透明质酸含量的变化空白对照组的HA含量最低,草酸钙处理组HA浓度明显升高（P<0.05）,而白藜芦醇组HA浓度明显低于对照组（P<0.05）。3.4乳酸脱氢酶（LDH）的检测空白对照组的LDH含量最低,加入CaOx晶体后,LDH含量显着增加（P<0.05）。白藜芦醇干预后,LDH含量明显下降（P<0.05）,提示白藜芦醇具有显着的细胞修复功能。4.白藜芦醇通过上调SIRTl/FOXO3a可抑制草酸钙结石诱发的肾小管上皮细胞氧化应激损伤,进而抑制结石形成4.1白藜芦醇改善了草酸钙晶体诱发的肾小管上皮细胞氧化应激损伤并增加了SIRT1的表达4.1.1 HK-2 细胞中 SOD、CAT、ROS 及 MDA 的变化草酸钙晶体干预后,HK-2细胞中SOD、CAT均显着下降（P<0.05）,而ROS、MDA显着上升（P<0.05）。白藜芦醇干预后,SOD活性及CAT表达明显增加（P<0.05）,ROS总量及MDA含量下降明显（P<0.05）。4.1.2 HK-2细胞中OPN、KIM-1的变化草酸钙晶体干预后,HK-2细胞中OPN、KIM-1表达量显着上升（P<0.05）。白藜芦醇干预后,OPN、KIM-1表达量明显下降（P<0.05）。4.1.3 HK-2细胞中SIRT1及其脱乙酰活性、FOXO3a、乙酰化FOXO3a的变化白藜芦醇能明显逆转草酸钙晶体诱发的SIRT1蛋白表达减少的趋势,增加SIRT1脱乙酰化活性及FOXO3a的表达（P<0.05）。同时白藜芦醇组细胞中乙酰化FOXO3a的表达较单纯草酸钙组明显下降（P<0.05）。4.2 SIRT1参与了对草酸钙晶体刺激的肾小管上皮细胞中氧化应激反应的调控4.2.1 SIRT1RNA干扰后,HK-2细胞中SOD、CAT、ROS及MDA等氧化应激指标及FOXO3a、乙酰化FOXO3a的变化与CON siRNA转染组相较,SIRT1 siRNA转染的肾小管上皮细胞中SIRT1的基因和蛋白表达明显减少（P<0.05）,SOD活性、CAT含量及FOXO3a表达下降（P<0.05）,ROS总量、MDA含量及乙酰化FOXO3a表达升高（P<0.05）。白藜芦醇干预后,CON siRNA转染组细胞中各项氧化应激指标改善明显,FOXO3a蛋白表达水平增加而乙酰化FOXO3a表达减少（P<0.05）;与之相反,SIRT1 siRNA转染组细胞中各项氧化应激指标改善不明显,FOXO3a表达增加及乙酰化FOXO3a表达减少不明显（P<0.05）。4.2.2 SIRT1RNA干扰后,HK-2细胞中OPN、KIM-1的变化与CON siRNA转染组相较,SIRT1 siRNA转染组细胞中OPN及KIM-1的表达量增加（P<0.05）;在白藜芦醇干预后,两组细胞中OPN及KIM-1的表达量均出现了不同程度的下降,但SIRT1 siRNA转染的细胞组其表达量仍较高（P<0.05）。4.3白藜芦醇改善了草酸钙大鼠肾脏的代谢指标、结晶沉积及肾组织病理异常白藜芦醇可降低草酸钙大鼠模型的血尿素氮和肌酐,减少尿中草酸、钙、磷的含量（P<0.05）。同时,白藜芦醇可以减少草酸钙大鼠肾脏的晶体沉积,改善其病理异常,具有抑制结石形成和保护肾脏的作用。4.4白藜芦醇改善了草酸钙大鼠肾脏的氧化应激损伤并增加了 SIRT1的表达4.4.1大鼠肾脏中SOD、CAT及MDA的变化与正常对照组大鼠相较,造模组大鼠肾脏SOD活性明显降低,CAT表达明显减少,而MDA的含量明显增加（P<0.05）。白藜芦醇治疗后,SOD活性及CAT表达明显增加,而MDA的含量明显减少（P<0.05）。4.4.2大鼠肾脏中OPN及KIM-1的变化与细胞实验一致,正常对照组大鼠肾脏组织中OPN的表达最少,造模组大鼠肾脏组织中OPN表达明显增加（P<0.05）。白藜芦醇干预后,与造模组相比,OPN表达明显减少,且与治疗剂量呈正比（P<0.05）。KIM-1的表达水平与OPN相似。4.4.3大鼠肾脏中SIRT1及脱乙酰活性、FOXO3a、乙酰化FOXO3a的变化与正常对照组大鼠相较,造模组大鼠肾脏SIRT1及FOXO3a表达明显减少,SIRT1脱乙酰化活性降低,而乙酰化FOXO3a表达明显增加。白藜芦醇治疗后,大鼠肾脏上述指标发生逆转。研究结论1.Ca原子可稳定吸附于C14H1203分子表面,竞争性抑制草酸钙的生成,这是首次从原子和分子角度阐述C14H1203防治草酸钙肾结石的机理,为以白藜芦醇为基础的药物研发提供了思路和依据。2.网络药理学分析结果提示白藜芦醇可以通过多靶点、多通路发挥防治肾结石的药效。SIRTl/FOXO3a通路介导的肾脏氧化应激反应可能在白藜芦醇抗肾结石的过程发挥重要作用,这为进一步的生物实验提供了重要参考。3.体外实验证实白藜芦醇可以抑制草酸钙晶体与肾小管上皮细胞的粘附,增加细胞活力,减少受损细胞透明质酸及乳酸脱氢酶的分泌,具有抑制细胞凋亡及修复受损细胞的潜能。4.白藜芦醇具有抑制草酸钙结石形成的药理作用,其机制可能是通过调控SIRT1/FOXO3a,抑制草酸钙晶体诱发的肾脏氧化应激损伤来实现的。
吕丽[9]（2021）在《基于代谢组学的人脐带间充质干细胞对FSGS小鼠干预作用的研究》文中提出研究背景局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis,FSGS）是最易导致终末期肾病（end-stage kidney disease,ESKD）的原发性肾小球疾病之一。FSGS的患病率在世界范围内逐年攀高,而免疫抑制治疗只能使40-60%的病例达到完全或部分缓解,且受剂量、毒性限制,目前治疗方法面临着困境和挑战。因此,寻找一种新的治疗方法来预防或阻止FSGS进展是医疗保健的首要任务。间充质干细胞（cord mesenchymal stem cells,MSCs）的抗炎、旁分泌和再生等特性有助于肾损伤的修复,在急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）、肾移植、糖尿病肾病及狼疮性肾炎等领域已经突显其治疗潜力,目前是肾脏疾病领域的研究热点。因此,MSCs有望成为治疗难治性FSGS的一种新策略。而脐带来源的间充质干细胞具有来源丰富,容易获得,较强的抗炎能力等特点,是一种理想的有治疗潜力的间充质干细胞。代谢组学是反映生物体发生的实时事件,同时能捕捉饮食和肠道菌群等外部影响因素,反映生物整体表型,在肾脏疾病的标志物和机制研究中具独特优势,目前代谢组学已渗透到多种肾脏疾病领域,但是FSGS的血清代谢谱未被全面、系统的研究,迄今为止也并未发现人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs）对阿霉素诱导的 FSGS小鼠模型干预作用后血清代谢谱变化的研究。研究目的该研究我们利用阿霉素在Balb/c雄性小鼠品系中建立FSGS模型,观察HUMSCs对FSGS小鼠的疗效,利用基于UPLC-MS/MS的代谢组学方法,分析HUMSCs对ADR诱导的FSGS小鼠干预治疗后血清代谢谱的变化,探讨参与FSGS发病的可能代谢机制,及从代谢组学的角度,分析HUMSCs对FSGS保护作用的机制。研究方法本研究第一部分,我们首先利用阿霉素在Balb/c雄性小鼠品系中建立FSGS模型,30只Balb/c雄性小鼠分为正常对照组（N=12）和FSGS模型组（N=18）。FSGS模型组的每只小鼠按照10.5 mg/kg的ADR（浓度为2 mg/mL）剂量给药,经尾静脉一次性缓慢注射入小鼠体内;正常对照组每只小鼠在相同时间点经尾静脉一次性注射等剂量的0.9%生理盐水。构建FSGS小鼠模型成功后处死正常组和模型组小鼠各6只,采用ELISA检测两组小鼠第28天的血清肌酐和尿素氮,以及第0、8、15、21、28天小鼠的尿蛋白。肾组织病理切片进行HE、PAS、Masson染色,光镜下观察结果。随后,将FSGS模型组12只小鼠随机分成FSGS+DiR-HUMSCs 组（N=6）和 FSGS+Siane 组（N=6）两组用于观察 HUMSCs在FSGS小鼠体内的示踪分布。正常对照组（N=6）和FSGS+DiR-HUMSCs组分别在第29、30、31天经尾静脉缓慢注射2×106cell/mL剂量的细胞膜荧光探针DiR标记的人脐带间充质干细胞（DiR-HUMSCs）到小鼠体内;FSGS+Siane组小鼠分别在第29、30、31天经尾静脉缓慢注入等剂量的0.9%生理盐水。6小时后处死所有小鼠,取出心脏、肺脏、肾脏、脾脏、肝脏,DiR-HUMSCs在阿霉素诱导的FSGS小鼠体内的示踪利用动物成像系统观察。肾组织冰冻切片行DAPI染色,共聚焦显微镜下观察结果。此外,Normal+DiR-HUMSCs、FSGS+DiR-HUMSCs及FSGS+Saline三组小鼠肾组织进行人源性和鼠源性间充质干细胞特异性抗体CD90、CD44的免疫组织化学染色,观察HUMSCs在FSGS小鼠肾组织中的定位。本研究第二部分,将18只Balb/c雄性小鼠,分成三组,即 Normal+Saline组（N=6）,FSGS+Saline 组（N=6）,FSGS+HUMSCs 组（N=6）。FSGS+HUMSCs组:FSGS小鼠造模成功后,分别在29、32、35天,经尾静脉缓慢注射移植HUMSCs（2× 106cells/mL）入小鼠体内。FSGS+Saline组:FSGS小鼠造模成功后,分别在29、32、35天,经尾静脉缓慢注射等剂量的0.9%生理盐水。Normal+Saline组:在相同时间点,经尾静脉缓慢注射等剂量的0.9%生理盐水入小鼠体内。第43天处死所有小鼠,血清离心后-80℃冰箱保存,用于代谢组学研究。肾组织行HE、PAS、Masson染色。利用ELISA方法检测三组小鼠尿蛋白、血清肌酐、尿素氮以及TNF-α的水平;RT-PCR方法检测肾组织BMP-7mRNA的表达;免疫组织化学技术检测TGF-β1和FN在肾组织的表达并进行半定量分析,光镜下观察结果。本研究第三部分,对第二部分研究中的三组小鼠血清进行代谢组学分析。小鼠血清经甲醇沉淀蛋白法处理后,制备用于代谢组学研究的血清样本,我们采用基于UPLC-MS/MS检测平台和多元统计分析相结合的手段分析三组小鼠血清代谢谱的差异研究结果人脐带间充质干细胞在阿霉素诱导的FSGS小鼠体内示踪的研究发现:（1）第28天,FSGS模型组小鼠较正常组小鼠尿蛋白增加,体重下降,血肌酐和尿素氮升高,且两组比较有统计学差异（P均<0.05）;光镜下观察FSGS小鼠肾组织HE、PAS、Masson染色结果,显示肾小球系膜细胞和基质重度增生,可见局灶节段性硬化,部分球囊黏连。肾小管上皮细胞刷毛缘脱落,官腔扩张并伴有多数蛋白管型形成。证实在第28天阿霉素诱导的FSGS小鼠模型造模成功。（2）动物成像系统下观察FSGS+DiR-HUMSCs组小鼠肾脏,共聚焦显微镜下DAPI染色的肾组织,可见较强的红色荧光分布,提示DiR-HUMSCs能够迁移至FSGS小鼠受损肾组织。（3）光镜下观察,FSGS+DiR-HUMSCs组小鼠肾组织可见人源性间充质干细胞特异性抗体CD90+、CD44+细胞的表达。然而,在FSGS+Siane组和Normal+DiR-HUMSCs小鼠肾组织未见到人源性间充质干细胞特异性抗体CD90+、CD44+表达的细胞;与 FSGS+Siane 组小鼠比较,FSGS+DiR-HUMSCs组小鼠肾组织中鼠源性间充质干细胞特异性抗体CD90+细胞轻度增加。人脐带间充质干细胞移植FSGS小鼠的效果及机制的研究发现:（1）与FSGS模型组比较,第43天时,FSGS+HUMSCs组小鼠尿蛋白、血肌酐、尿素氮水平显着下降,且有统计学差异（P均<0.01）。（2）肾组织行HE、PAS、Masson染色结果显示,与FSGS+Saline组比较,HUMSCs能明显改善FSGS+HUMSCs组小鼠肾组织病理损伤。（3）FSGS+Saline组小鼠肾组织BMP-7表达水平明显降低、TGF-β1和FN的表达显着增强,且血清TNF-α水平显着升高,与Normal+Saline组比较均有统计学差异（P均<0.01）。（4）HUMSCs干预治疗后,FSGS小鼠肾组织BMP-7水平明显增加、TGF-β1、FN的表达下降,且血清TNF-α水平显着降低,与FSGS+Saline组小鼠比较,均有统计学差异（P均<0.01）。人脐带间充质干细胞移植FSGS小鼠后血清代谢谱变化的研究发现:（1）Normal+Saline,FSGS+Saline和FSGS+HUMSCs三组小鼠的血清样本明显分离。（2）与Normal+Saline组比较,ADR诱导的FSGS小鼠血清代谢物氧化三甲胺、3’-唾液乳糖、N-乙酰缬氨酸、3-氯-L-酪氨酸水平显着被上调,而胆汁酸代谢产物、棕榈油酸、L-甲状腺素的水平显着被下调。（3）与FSGS+Saline组比较,HUMSCs移植FSGS小鼠后,小鼠血清代谢物L-甲状腺素和棕榈油酸水平显着被上调,而3’-唾液乳糖水平显着被下调,使异常的血清代谢物向正常水平恢复。（4）支链氨基酸代谢、不饱和脂肪酸的合成、甲状腺激素代谢及胆汁代谢途径参与ADR诱导的FSGS发生发展;不饱和脂肪酸的合成、甲状腺激素代谢可能介导HUMSCs对FSGS小鼠肾组织修复过程。（5）FSGS小鼠血清炎性因子TNF-a水平与代谢物氧化三甲胺和3’-唾液乳糖与呈显着性正相关（p均<005）。（6）血清代谢物3’-唾液乳糖对水平与尿蛋白和尿素氮水平呈显着性正相关（p均<005）。结论和意义（1）HUMSCs可以归巢到阿霉素诱导的FSGS小鼠损伤的肾组织中。（2）HUMSCs可以通过调节促炎症因子TNF-α、促纤维化因子TGF-β1及抗纤维化因子BMP-7的表达水平,从而抑制肾组织免疫炎症反应和细胞外基质沉积,达到改善FSGS小鼠肾脏功能和结构,发挥HUMSCs对FSGS的保护作用（3）基于UPLC-MS/MS的代谢组学研究,一组血清差异性代谢物氧化三甲胺,N-乙酰缬氨酸,3-氯-L-酪氨酸,胆汁酸代谢产物,棕榈油酸,L-甲状腺素,3’-唾液乳糖参与阿霉素诱导的FSGS的发生发展。支链氨基酸代谢、不饱和脂肪酸的合成、甲状腺激素代谢及胆汁代谢和合成是参与FSGS发生发展重要的代谢途径。HUMSCs可能通过抑制FSGS小鼠的炎性反应,逆转或改善循环中L-甲状腺素、棕榈油酸、3’-唾液乳糖和氧化三甲胺的水平,进而改善小鼠尿蛋白和尿素氮的水平,从而发挥肾脏保护作用。我们的发现可能为HUMSCs治疗FSGS提供了新的代谢机制和临床前数据。
秦田雨[10]（2020）在《肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究》文中指出[目的]从整体动物、细胞和分子水平,结合系统药理学靶点预测,研究中药复方肾康注射液（Shenkang,SK）对慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）和肾纤维化的保护作用和机制,为SK对CKD及肾纤维化的临床治疗提供更多的数据支持及科学依据。[方法]1.系统药理学:首先通过数据挖掘和文献查阅构建SK分子数据库,并通过药物相似性和药物半衰期评估来筛选活性分子;使用WES药物靶向模型来预测生物活性成分的直接药物靶向;使用Cytoscape 3.2软件构建复合物-靶标,靶标-通路和靶标-疾病网络,并根据BioGPS数据库确定靶标在组织和器官中的分布。2.整体动物:C57BL/6小鼠36只,采用随机对照设计法将小鼠按体重随机分为:假手术组,模型组,阳性药（ARB）组,SK高剂量组,SK中剂量组,SK低剂量组（n=6）。对模型组、ARB组、SK各剂量组小鼠实施UUO手术,制备肾纤维化模型,假手术组分离左输尿管但不结扎输尿管。术后第一天开始给药,共计14天。假手术组和模型组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,ARB组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10g,灌胃氯沙坦钾溶液0.15 mL（生药0.13 g）/10 g,SK高剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.08 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK中剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.04 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK低剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.02 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,实验过程中观察记录小鼠体重等一般情况,给药第13天行MRI扫描测定FA值明确活体肾纤维化程度,给药14天后摘眼球取血,称量肾脏重量,分别冻存固定肾脏。比色法测定血肌酐、血尿素氮、血CysC水平,行HE和天狼星红染色观察患侧肾脏病理形态学和纤维化程度,透射电镜观察超微结构情况,Western Blot检测各组小鼠肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅰ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平,Real-time PCR检测假手术组、UUO组和SK中剂量组肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,FSP-1、ECM成分(Col Ⅲ,JAK2、STAT3、TGF-β1和负调节分子SOCS1,SOCS3 mRNA水平。3.细胞:NRK-49F细胞进行复苏传代培养,以10 ng/mL 的TGF-β1刺激48 h诱导NRK-49F细胞增殖活化,不同浓度SK（0,1,2,4mg/mL）干预后,观察细胞形态、Western Blot检测NRK-49F细胞成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅲ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平和负调节分子Prdx5的表达,Real-time PCR检测NRK-49F细胞肌成纤维细胞标志物α-SMA,JAK2、STAT3 mRNA 水平。[结果]1.系统药理学部分:以DL≥0.6为筛选标准,“HL=long”用于定义适当的HL范围。最终选出88种化合物作为活性分子。利用WES算法和CTD、TTD筛选结果,确定了 85个与治疗CKD相关的潜在化合物作用靶点,包括STAT3。通过KEGG数据库映射获得关键通路,包括NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF通路,结合CKD病理机制的相关进展,构建了 CKD治疗模块的通路,包括炎症、增殖、分化、迁移、通透性、降解等模块。对靶标-疾病相互作用网络的深入分析表明,SK治疗CKD主要通过影响6种疾病发挥作用:泌尿生殖系统疾病、代谢性疾病、内分泌疾病、心血管疾病,病理过程和免疫疾病。组织定位结果显示SK通过包括肾脏、肝脏、肺和心脏在内的组织模块发挥作用。2.整体动物部分:（1）肾功能检测:与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏血CREA、BUN、Cys-C水平显着性升高（p<0.01）;与UUO组相比,ARB和高剂量SK组小鼠血CREA水平显着降低（p<0.01）;与UUO组相比,ARB和SK各剂量组小鼠血BUN水平显着降低（p<0.05或p<0.01）;与UUO组相比,SK高剂量组小鼠血Cys-C水平显着降低（p<0.05）。（2）肾脏重量和病理检测:与假手术组相比,UUO模型组的患侧肾质量/体重、患侧肾/对侧肾质量、对侧肾质量/体重均显着增加（p<0.05或p<0.01）。但各药物治疗后对UUO小鼠肾脏重量各指标没有产生影响。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏FA值显着性升高（p<0.01）;与UUO组相比,ARB阳性药组、SK高中低剂量组FA值显着降低（p<0.01或p<0.001）,其中以SK中剂量组最为显着（p<0.001）。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏病理损伤明显;与UUO组比较,各治疗组肾脏损伤情况均有不同程度缓解,细胞外基质积聚、炎性细胞浸润、肾小管扩张和/或萎缩减轻,以SK中剂量组和高剂量组较好。与假手术组比较,UUO组小鼠天狼星红面积极显着增加（p<0.001）;与UUO组比较,ARB组、SK高、中、低剂量组小鼠患侧肾脏天狼星红染色红色面积显着减少（p<0.05或p<0.01）。电镜下观察各浓度SK对UUO所致的细胞器丰富的成纤维细胞增多,间质局灶胶原纤维增生和肾小管凋亡均有一定的改善作用。（3）Western blot检测:与假手术组相比,UUO组α-SMA蛋白水平显着增加（p<0.01）,与UUO比较,SK中剂量组和低剂量组显着下调了 UUO状态下的α-SMA蛋白水平升高（p<0.05）;与假手术组相比,UUO组Col Ⅰ蛋白水平显着增加（p<0.01）,与UUO 比较,SK中剂量组显着下调了 Col Ⅰ蛋白水平升高（p<0.05）;与假手术组相比,UUO组p-STAT3（Try705位点）/STAT3比例显着增加（p<0.01）,与UUO比较,SK中（p<0.01）、低剂量（p<0.001）组显着下调了 Try705位点的STAT3磷酸化程度;与假手术组相比,UUO组p-JAK2（Try1007位点）/JAK2比例有上升趋势,但无统计学差异,与UUO 比较,SK高剂量组显着下调了 Try1007位点的JAK2磷酸化程度（p<0.05）,（4）PCR检测:与假手术组相比,UUO组小鼠患侧ECM成分Col Ⅰ、Col Ⅲ、FN,成纤维细胞活化标志物α-SMA、FSP-1,以及 JAK2、STAT3、TGF-β、JAK2/STAT3 通路负调节因子SOCS1、SOCS3 mRNA水平显着上升（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;与UUO组相比,SK中剂量组显着降低了 Col Ⅰ、ColⅢ、FN,α-SMA、FSP-1,JAK2、TGF-β、SOCS1、SOCS3 mRNA 水平（p<0.05 或p<0.01）。3.细胞实验:TGF-β1诱导后,NRK-49F细胞的细胞骨架显示出内部微丝束,并逐渐增厚和伸长,丧失纺锤形或星形成纤维细胞外观。不同浓度的SK一定程度上逆转了TGF-β1诱导的形态变化和增殖。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞p-STAT3（Try705位点）/STAT3、Prdx5蛋白水平显着性升高（p<0.05）,p-JAK2（Try1007位点）/JAK2有一定程度升高但未达统计学意义（p>0.05）;与模型对照组相比,4 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的STAT3蛋白Try705位点的磷酸化水平显着降低（p<0.05）,1 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的JAK2蛋白Try1007位点的磷酸化水平显着降低（p<0.05）,4 mg/mL SK组细胞的Prdx5蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞α-SMA、JAK2、STAT3 mRNA水平显着升高（p<0.05或p<0.001）;与模型对照组相比,ARB及不同浓度SK均极显着地降低了α-SMA mRNA 水平（p<0.001）,与模型对照组相比,ARB、1mg/mL、2 mg/mL SK（p<0.05）及 4 mg/mL SK（p<0.01）显着降低了 STAT3 mRNA 水平,与模型对照组相比,ARB及4 mg/mL SK显着降低了 JAK2 mRNA水平（p<0.05）。[结论]（1）系统药理学预测显示SK中多种化合物可能通过作用于与炎症、凋亡、增殖等相关的NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF等多通路的靶点分子治疗CKD。（2）SK有效改善UUO小鼠肾功能指标和肾间质纤维化,其机制可能是通过调节JAK2/STAT3信号通路抑制成纤维细胞活化实现的,验证了系统药理学结果。（3）SK还能够抑制TGF-β1诱导NRK-49F增殖活化以及ECM产生,其作用机制可能是通过抑制JAK2/STAT3通路的激活介导的。
二、肾小管上皮细胞与基底膜的粘附力学特性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肾小管上皮细胞与基底膜的粘附力学特性（论文提纲范文）
（1）EZH2抑制剂3-DZNeP在草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分:EZH2抑制剂3-DZNeP对高草酸尿症大鼠模型诱导的肾损伤及结石形成的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分:EZH2抑制剂3-DZNeP在草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分:EZH2抑制剂3-DNZeP通过抑制JNK/FoxO3a通路来减轻草酸诱导的肾损伤 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 组蛋白甲基化修饰在肾脏疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（2）CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ CD26阳性尿外泌体与重症患者急性肾损伤预后关系的前瞻性队列研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2 方法与材料 |
| 3 结果 |
| 4 讨沦 |
| 5 结论 |
| 6 局限性 |
| 附图与附表 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ CD26阳性外泌体对急性肾损伤后肾脏修复作用的机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5.结论 |
| 6.局限性 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞外囊泡与肾脏疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 发表论文1 |
| 发表论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）电针预处理对高血糖小鼠肾脏保护效应及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 “足三里”、“肾俞”电针预处理对小鼠血糖及高血糖诱导的肾组织损伤的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 取材及处理 |
| 3 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 5.讨论 |
| 实验二 电针预处理对高血糖小鼠肾小球足细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 取材及处理 |
| 3 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 5 讨论与小结 |
| 实验三 电针预处理对高血糖小鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 取材及处理 |
| 3 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 5 讨论与小结 |
| 实验四 电针预处理对TRPC6表达及ERK磷酸化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 取材及处理 |
| 3 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 5 讨论与小结 |
| 讨论 |
| 1 中医对高血糖的认识 |
| 2 现代医学对高血糖肾损伤的认识 |
| 3 动物模型评价 |
| 4 选穴依据 |
| 5 电针预处理对高血糖肾损伤的防治优势 |
| 6 电针预处理对高血糖小鼠肾脏保护效应的可能作用机制 |
| 7 本课题创新点 |
| 8 问题与展望 |
| 9 结语 |
| 参考文献 |
| 附录一 文献综述 TRPC6与DN足细胞损伤的相关机制研究及中医药治疗进展 |
| 1 DN的病理基础 |
| 2 足细胞与肾小球滤过屏障 |
| 3 足细胞损伤与DN |
| 4 裂孔隔膜相关蛋白与足细胞的功能 |
| 5 TRPC6与足细胞的生理功能及病理损伤 |
| 6 中医对DN的认识及干预措施 |
| 参考文献 |
| 附录二 博士期间科研成果和科研经历 |
| 已发表论文 |
| 参加项目 |
| 致谢 |
（4）SAHA通过调控TGFβ/Smad信号通路在结晶肾损伤模型EMT中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:基因芯片技术分析TGF-β对于肾小管上皮细胞的作用 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果与讨论 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:草酸钙结晶肾损伤模型的构建 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果与讨论 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分:SAHA调控TGFβ/Smad信号通路影响草酸钙结晶肾损伤模型中EMT表达 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果与讨论 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 EMT与肾纤维化 |
| 参考文献 |
| 发表论文及科研成果 |
| 致谢 |
（5）滋肾丸干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 糖尿病肾病炎症机制及中医药干预研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 糖尿病肾病炎症反应的主要参与成分 |
| 3 糖尿病肾病炎症反应的主要信号转导通路 |
| 4 糖尿病肾病炎症反应的中医病机与辨证 |
| 5 中医药干预糖尿病肾病炎症反应的作用及机制 |
| 6 中医药防治糖尿病肾病炎症反应的现代研究方法 |
| 参考文献 |
| 综述二 滋肾丸临床应用及相关研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 滋肾丸的源流与命名 |
| 3 滋肾丸的方证与方义 |
| 4 滋肾丸的制方与化裁 |
| 5 滋肾丸的名家应用经验 |
| 6 滋肾丸的临床应用研究 |
| 7 滋肾丸的现代研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 滋肾丸干预糖尿病肾病小鼠肾小管上皮细胞焦亡作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 实验二 滋肾丸干预高糖培养的人近端肾小管上皮细胞焦亡作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 实验三 滋肾丸治疗糖尿病肾病网络药理学研究 |
| 1 资料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（6）E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分: E3泛素连接酶TRIM31调控高血压肾病发生的实验研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: E3泛素连接酶TRIM31改善高血压肾病的分子机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（7）基于“孙络-玄府”理论论治糖尿病肾病及通心络干预研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 从“孙络-玄府”论治糖尿病肾病理论探讨 |
| 1 糖尿病肾病古今探源 |
| 1.1 中医病名沿革 |
| 1.2 病因病机论述 |
| 1.3 治则治法及方药论述 |
| 1.4 小结、不足与展望 |
| 2 基于气络学说“孙络-玄府”理论论治消渴病肾病(DKD) |
| 2.1 气络学说概述 |
| 2.2 “孙络-玄府”概念与功能特点 |
| 2.3 气络学说“孙络-玄府”理论指导消渴病肾病(DKD)研究 |
| 2.4 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 通心络对DKD模型db/db小鼠的肾脏保护作用 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计学处理 |
| 结果 |
| 1. 各组小鼠一般情况观察 |
| 2. 各组小鼠不同时间点体重及血糖变化 |
| 3. 各组小鼠不同时间点尿微量白蛋白肌酐比值(UACR),24 h尿白蛋白排泄率(AER)变化 |
| 4. 各组小鼠取材后血清生化指标结果 |
| 5. 各组小鼠肾脏H&E、PAS染色 |
| 6. 各组小鼠Col Ⅰ和Col Ⅳ免疫组织化学染色 |
| 7. 各组小鼠Tunel和AQP1免疫荧光双重染色 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 通心络对高糖高脂培养下人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)程序性细胞死亡(PCD)的作用 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 观察指标及检测方法 |
| 结果 |
| 1. 不同浓度葡萄糖和棕榈酸对HK-2细胞活力的影响 |
| 2. 不同浓度的通心络对高糖高脂损伤下HK-2细胞活性的影响 |
| 3. TXL对高糖高脂损伤的HK-2细胞死亡的影响 |
| 4. 通心络对高糖高脂损伤下HK-2程序性细胞死亡的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 通心络对DKD模型db/db小鼠肾脏细胞凋亡和细胞焦亡的作用 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计学处理 |
| 结果 |
| 1. 通心络对DKD模型db/db小鼠肾脏组织细胞凋亡的影响 |
| 2. 通心络对DKD模型db/db小鼠肾脏组织细胞焦亡的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 肾小管上皮细胞程序性细胞死亡在糖尿病肾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 主要中英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）白藜芦醇抑制肾草酸钙结石形成及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 基于第一性原理的白藜芦醇对钙的吸附性能研究 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 基于网络药理学的白藜芦醇防治肾结石的作用机制研究 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 白藜芦醇体外对草酸钙结石晶体粘附的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 白藜芦醇通过调节SIRT1/FOXO3a抑制草酸钙结石诱发的肾脏氧化应激损伤 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 研究总结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 综述 肾草酸钙结石发病机制及防治的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| Paper one |
| Paper Two |
（9）基于代谢组学的人脐带间充质干细胞对FSGS小鼠干预作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一部分 人脐带间充质干细胞在阿霉素诱导的FSGS小鼠体内示踪的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人脐带间充质干细胞移植FSGS小鼠的疗效及机制的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 人脐带间充质干细胞移植FSGS小鼠后血清代谢组变化的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 课题的创新性 |
| 课题的不足之处 |
| 综述 间充质干细胞的特性及在肾脏疾病中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 附图表 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文及奖励 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
（10）肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 慢性肾脏病肾纤维化的现代研究进展 |
| 1 病因研究 |
| 2 发病机制研究 |
| 3 治疗与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药防治慢性肾脏病研究进展 |
| 1 病名研究 |
| 2 病因病机研究 |
| 3 防治研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 肾康注射液治疗慢性肾脏病的系统药理学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果和讨论 |
| 3 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 肾康注射液对UUO小鼠肾间质纤维化的保护作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 肾康注射液对NRK-49F人鼠肾间质成纤维细胞活化的作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 主要研究成果 |
| 个人简历 |
四、肾小管上皮细胞与基底膜的粘附力学特性（论文参考文献）
- [1]EZH2抑制剂3-DZNeP在草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用和机制研究[D]. 高小民. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究[D]. 杜鹃. 山东大学, 2021(11)
- [3]电针预处理对高血糖小鼠肾脏保护效应及机制的研究[D]. 李丹. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [4]SAHA通过调控TGFβ/Smad信号通路在结晶肾损伤模型EMT中的作用及机制研究[D]. 张欢. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [5]滋肾丸干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡作用及机制研究[D]. 郭晓媛. 北京中医药大学, 2021(01)
- [6]E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究[D]. 张杰. 山东大学, 2021
- [7]基于“孙络-玄府”理论论治糖尿病肾病及通心络干预研究[D]. 沈双. 南京中医药大学, 2021(01)
- [8]白藜芦醇抑制肾草酸钙结石形成及其机制的研究[D]. 王滕滕. 山东大学, 2021(11)
- [9]基于代谢组学的人脐带间充质干细胞对FSGS小鼠干预作用的研究[D]. 吕丽. 山东大学, 2021(10)
- [10]肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究[D]. 秦田雨. 北京中医药大学, 2020(04)