一、林木转基因工作研究进展（论文文献综述）
林昕[1]（2021）在《白桦BpERF1.1基因在低温、干旱和盐胁迫中的功能研究》文中认为高低温、盐碱化、旱涝等非生物胁迫不但严重影响着植物的生长发育,还制约着作物产量和品质的提高。植物在漫长的进化过程中形成了一套完善的应对外界胁迫的防御体系,在遭受胁迫影响时,植物迅速感知并传递胁迫信号,激活逆境响应转录因子,从而启动下游抗逆相关功能基因的表达,使植物体内产生一系列生理生化反应,从而提高植物的抗逆能力。乙烯响应因子（Ethylene response factor,ERF）转录因子是植物中特有的一类转录因子,属于AP2/ERF转录因子家族中ERF亚家族的一员。ERF转录因子可以通过识别并结合GCC-box和DRE/CRT顺式元件来调控下游基因的表达。本研究团队在白桦（Betulaplatyphylla）中鉴定并克隆出BpERF1.1基因,是拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtERF1基因的一条同源基因。为了探索BpERF1.1基因在非生物胁迫中的功能,以野生型及过表达BpERF1.1基因白桦为实验材料开展本项研究,主要取得了以下结果:（1）将BpERF1.1基因连接到pMDTM 19-T入门克隆载体上,以便于后续对BpERF1.1基因的表达模式和功能进行分析。构建pBI121-BpERF1.1-GFP融合表达载体,利用基因枪法将其瞬时转化到洋葱表皮细胞,激光共聚焦显微镜下观察GFP蛋白的发光情况,获得BpERF1.1基因的定位信息。结果表明BpERF1.1基因定位于细胞核中。（2）以qRT-PCR技术分析了BpERF1.1基因在不同组织部位和低温胁迫下的表达模式,研究发现BpERF1.1基因在白桦的根、茎和叶片中均有表达,且具有特异性;低温处理（4℃）的24h内,BpERF1.1基因的表达量持续上调,表明BpERF1.1基因可被低温条件诱导。（3）构建BpERF1.1基因的过表达载体（pROK II-BpERF1.1）,通过农杆菌侵染法转入白桦叶片中,筛选抗性愈伤组织并进行继代培养,从中筛选出了 11个成功过表达BpERF1.1基因的白桦植株,用于研究非生物胁迫下BpERF1.1基因的功能。（4）对野生型白桦和过表达BpERF1.1基因白桦进行低温和盐胁迫处理,通过观测其表型变化和测定相对电导率、MDA含量、SOD酶活性、POD酶活性、CAT酶活性、PRO含量等生理指标,研究野生型和转基因白桦在非生物胁迫下的抗逆能力。研究发现在胁迫处理后,转基因白桦的受损情况显着轻于野生型,且转基因白桦细胞内MDA含量显着低于野生型的现象证实了这一点;转基因白桦细胞内SOD酶活性、POD酶活性、PRO含量等生理指标显着高于野生型,表明过表达BpERF1.1基因可能导致一些过氧化物清除酶和修复蛋白等含量的升高,减小胁迫后活性氧所致的损伤,增强胁迫后的自我修复,从而提高白桦对胁迫的耐受力。（5）对过表达BpERF1.1基因白桦进行转录组测序,以野生型白桦为对照组分析其中的差异表达基因。将差异基因进行“生物过程”的GO富集分析,最终筛选出30个参与响应刺激的基因,其中包括响应胁迫、响应非生物刺激等。其中包含众多与抗逆相关的功能基因与转录因子,如HSP17.6C、MYB30、PRKⅡE、GI等基因,它们均与植物抗逆能力息息相关,且被BpERF1.1基因的过表达所上调表达。过表达BpERF1.1基因使这些抗逆相关基因的表达量发生改变,从而提高了白桦对逆境的耐受能力。
胡晓晴[2]（2021）在《白桦BpSPL基因家族鉴定及BpSPL2基因在不定根发生中的功能研究》文中研究指明白桦（Betula platyphylla Suk.）是东北三省蓄积量最大的速生乡土阔叶树种,然而其硬枝扦插难以产生不定根,属于难生根、难成活树种。因此,提高白桦不定根发生能力并揭示其分子机制,对于完善白桦的无性繁殖理论和技术推广应用具有非常重要的科学意义。已有研究表明SPL转录因子在植物生长发育、生殖发育及逆境应答中起重要调控作用,但其参与不定根发生的分子机理仍不清楚,尤其是对木本植物。在本研究中,我们鉴定了白桦BpSPL基因家族,进一步利用分子生物学手段对白桦BpSPL2基因的分子功能以及其参与不定根发生的分子机制进行了初步探索。（1）结合白桦基因组和转录组数据鉴定了20个BpSPLs基因和4个miR156前体序列。通过对系统发育关系、保守基序和miR156介导的转录后调控的综合分析,明确了BpSPLs基因家族的基本特征。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术开展了BpSPLs基因在组织表达特性、雌、雄花序、叶片发育以及不定根发生过程中的表达模式研究。其中,BpSPL2基因在损伤诱导的不定根发生过程中表达量显着提高,特别是在损伤处理后的5至12小时,表达量提高了60-80倍,暗示其在白桦不定根发生中起重要作用。（2）克隆了白桦BpSPL2基因。该基因含有3个外显子和2个内含子,其开放阅读框为1566 bp,编码521个氨基酸。BpSPL2编码的蛋白具有SBP结构域,包括2个锌指结构和1个核定位信号。亚细胞定位结果发现BpSPL2蛋白定位于细胞核和细胞质中。（3）通过对BpSPL2启动子序列（起始密码子上游1956 bp）分析发现,该区域含有根特异表达相关元件和多种激素及伤害响应元件,暗示BpSPL2基因可能参与根的发育,并受伤害和激素诱导。进一步克隆了BpSPL2基因启动子序列并构建植物表达载体,对获得的BpSPL2pro::GUS转基因白桦和拟南芥进行时空表达分析,发现该启动子主要驱动BpSPL2基因在根尖分生组织和顶芽中特异性表达。对BpSPL2pro::GUS转基因白桦不定根发生过程进行GUS染色分析发现,BpSPL2启动子主要在不定根形成的早期在茎基部伤口处活性较强。（4）分别获得BpSPL2过表达（35S::BpSPL2）和抑制表达（35S::BpSPL2-SRDX）白桦转基因株系。与野生型白桦相比,BpSPL2抑制表达植株生根时间提前了 2-3天,其不定根数目增长了 4 1.6%-66.9%;而BpSPL2过表达植株会使生根推迟3-4天,不定根数目下降了 46.7%-47.6%,总长度降低46.9-50.3%,这说明BpSPL2对不定根的发生起负调控作用。对BpSPL2转基因白桦地上部分进行表型分析发现,相对于野生型,BpSPL2过表达植株出现矮化、茎直径减小以及节间数量减少的表型;而BpSPL2抑制表达植株的株高、茎直径和节间数量明显高于野生型和BpSPL2过表达植株。说明BpSPL2不但调控白桦不定根的发生,并且影响了营养器官的生长和发育。（5）通过高通量测序技术对野生型、35S::BpSPL2过表达以及35S::BpSPL2-SRDX抑制表达白桦在不定根发生不同时期的茎伤口基部组织进行转录组测序。六个比较组WT-0.5h vs OE-0.5h、WT-0.5h vs R-0.5h、WT-24h vs OE-24h、WT-24h vs R-24h、WT-96h vs OE-96h、WT-96h vs R-96h 中分别获得 2637、2129、1554、1754、2044 和 2047个差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）。GO分析发现,DEGs在氧化还原过程、核苷酸结合、氧化还原酶活性中的富集度最高。在6个比较组的DEGs中,鉴定了许多参与生长素合成及信号转导、GA信号途径、JA信号途径以及ERF、WOX、LBD等转录因子。BpSPL2影响不定根发生可能和这些基因的表达改变有关。（6）利用生物信息学方法预测了BpSPL2基因直接调控的靶基因,其中DOT2和CTL1基因与根的发育相关。qRT-PCR分析表明,它们分别在35S::BpSPL2和35S::BpSPL2-SRDX转基因白桦不定根发生过程中呈现相反的表达模式,认为DOT2和CTL1基因可能是BpSPL2影响不定根发生的直接靶基因,但还需要进一步实验验证。综上所述,本研究对BpSPL基因家族进行了生物信息学分析和表达特性研究,这将为后续研究BpSPLs的基因功能奠定基础;进一步围绕BpSPL2开展了启动子活性、基因功能及转录组测序的研究。揭示了BpSPL2在白桦不定根发生过程中的作用,为白桦等难生根树种的不定根形成机制提供了基因资源。
刘炎[3]（2021）在《小黑杨单倍体愈伤悬浮培养体系建立及遗传转化PsnCYCD1;1研究》文中指出单倍体植物具有基因组小、基因型纯合、遗传转化容易等优点,被广泛应用于植物领域基础研究中。植物周期蛋白基因CYCD1;1具有控制细胞分裂、促进植物生长发育的功能。本实验以小黑杨单倍体愈伤为实验材料,利用正交试验优化其悬浮培养体系,并获得PsnCYCD1;1转基因愈伤,初步探究PsnCYCD1;1对小黑杨单倍体愈伤生长及基因表达情况的影响。主要结果如下:（1）小黑杨单倍体细胞系悬浮培养最佳植物生长调节剂条件为1.25 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L KT。在该条件下培养的细胞系颜色鲜黄,未发生褐化,细胞呈圆形或椭圆形,单细胞居多,并且细胞活性最好。（2）不同蔗糖浓度（3%、5%、7%）与不同初始接种量（1.3 g、1.5 g、1.7 g）对悬浮培养单倍体细胞的生长有显着影响,5%的蔗糖和1.5 g初始接种量为最适条件。（3）利用最佳悬浮培养体系对单倍体细胞系进行悬浮培养,细胞系鲜重在第18 d达到最大值,为16.28 g,因此单倍体细胞系悬浮培养的周期为18 d。（4）构建pROKⅡ-PsnCYCD1;1植物过表达载体,对单倍体细胞系进行遗传转化。通过PCR和荧光定量PCR检测,共获得14个转基因单倍体细胞系,其中PsnCYCD1;1-L1、PsnCYCD1;1-L5和PsnCYCD1;1-L7 表达量较高。（5）分析比较转PsnCYCD1;1基因单倍体细胞系与未转化细胞系悬浮培养生长状况,结果表明转基因单倍体细胞系比非转基因单倍体细胞系生长速度快;经显微观察,转基因细胞小于非转基因细胞,是非转基因细胞的85%。（6）RNA-Seq检测转PsnCYCD1;1基因单倍体细胞系与未转基因单倍体细胞系,显示共同差异表达基因为8644个。共检测到58个转录因子家族,占比较高的为参与细胞生长发育的MYB和AP2-EREBP。GO分析结果表明其主要富集于细胞内组分的生物合成。KEGG分析显示其主要富集于RNA转运与核糖体调控等代谢途径。过表达PsnCYCD1;1基因对小黑杨单倍体细胞系的代谢产生了广泛影响,进而参与调控单倍体细胞的生长。（7）利用荧光定量PCR分析,PsnCYCD1;1在小黑杨单倍体细胞系中过表达后,PsnE2F1;1、PsnELP1和PsnH4基因表达量均上升。PsnE2F1;1在PsnCYC1;1-L7中上调表达量最高,达到3倍以上。
刘慧新[4]（2021）在《PtrCAld5H2和PtrCOMT2基因在84K杨中的共同遗传转化研究》文中进行了进一步梳理木质素是植物体内广泛存在的大分子物质,在植物适应外界的环境过程中也发挥作用。木质素由 H 型（p-coumaryl alcohol）,G 型（Coniferyl alcohol）,S 型（Sinapyl alcohol）三种不同的木质素单体通过不同比例组成。不同种植物之间木质素单体比例不同导致木质素理化性质不同限制了木材的应用,因此改变木质素含量的策略具有重要意义。本文主要通过从毛果杨中克隆获得的PtrCAld5H2和PtrCOMT2两个基因,利用生物信息学软件,对两个基因的功能进行分析和预测,构建双价表达载体并稳定转化到84K杨中,进一步探究PtrCAl5H2和PtrCOMT2两个基因对S型木质素,木质素单体比例及木质素含量的影响。主要研究结果如下:（1）PtrCAld5H2基因的cDNA长度为1545 bp,共编码514个氨基酸。GenBank登录号为EU603311。PtrCAld5H2基因蛋白分子式C2625H4132N704O744S32,为亲水性稳定蛋白。PtrCOMT2基因的cDNA长度为1095 bp,共编码364个氨基酸。GenBank登录号为EU603317。PtrCOMT2基因蛋白分子式为C1784H2800N452O524S24。为不稳定疏水性蛋白。对PtrCOMT2蛋白的保守结构域进行预测,结果表明,保守区包含从35位至85位的氨基酸,该基因属于dimer ization2 superfamily家族,包含dimer ization保守结构域。保守区包含从140位至345位的氨基酸,该基因属于AdoMetMTases superfamily家族,包含Methyltransf2保守结构域。（2）成功构建过表达载体,利用农杆菌介导法转化84K杨后获得了11个转基因株系。DNA和RNA水平检测结果均表明,PtrCA ld5H2和PtrCOMT2基因已经成功整合到了 84K杨中;实时荧光定量PCR检测结果显示,以PtrCAld5H2和PtrCOMT2基因相对表达量最低的84K杨转基因株系L7为参考,PtrCAld5H2基因相对表达量在L8、L9、L10转基因株系中较高,分别是L1的16倍,21.7倍和25.9倍;PtrCOMT2基因相表达量在L8,L10和L9相对表达量较高,分别为L7的4.4倍、7倍和7.7倍。（3）转基因84K杨,与野生型WT相比木质素含量均无显着变化。（4）将过表达PtrCA ld5H2和PtrCOMT2过表达转基因株系L8,L9和L10及野生型84K杨的茎段通过HPLC方法进行木质素单体含量的检测与分析,结果发现在转基因株系与野生型中S型木质素单体和G型木质素单体含量有变化,但是S型木质素与G型木质素的比值与WT相比差异不大。
刘彩霞[5]（2021）在《小黑杨单倍体悬浮细胞筛选体系的建立及应用研究》文中研究表明植物悬浮细胞可为植物研究提供一个简化的模型系统,它的开发和应用目前主要集中在草本植物和农作物中,在林木中的应用研究还鲜有报道。与草本植物相比,木本植物具有明显的次生生长特点,使其在应激反应调节,信号转导调控等方面存在差异,因此在诸多科研探究中,草本植物悬浮细胞系具有明显的局限性,不能够完全替代木本植物细胞系进行研究。小黑杨（Populus simonii ×P.nigra）是在上世纪五六十年代由育种工作者人工杂交选育而成,以欧洲黑杨和小叶杨为父母本,由于生长快,适应性强,兼具耐寒、耐旱、耐盐碱等特点而被广泛种植。本文以小黑杨为研究材料,通过对小黑杨花药进行愈伤诱导,通过对单倍体群体的筛选,从而获得具有优良性状的单倍体细胞系Qu-1,并对Qu-1 在分子生物学上的应用进行了深入研究,建立了系统的小黑杨单倍体细胞系应用体系,揭示了小黑杨单倍体细胞系具有广泛的应用前景和价值,可为植物领域尤其是林木分子生物学研究提供优良的试验材料。其主要研究结果包括:（1）小黑杨单倍体愈伤组织诱导体系的建立:通过对本地区小黑杨的物候情况进行观察,小黑杨雄蕊于每年3月开始萌动,4月中旬可观察到花药处于不同的发育时期。以不同发育时期的小黑杨花药为外植体,经常规消毒处理后,进行愈伤组织诱导,并对获得的愈伤进行继代培养,流式细胞仪倍性检测,k-mer分析以及植株再生诱导等一系列实验。通过对愈伤组织诱导情况进行统计,共获得3000个愈伤组织,同时发现当花药处于单核靠边期时,诱导效率最高;经杂合度及倍性检测最终获得300个单倍体愈伤组织,其中有20个单倍体愈伤组织已经获得完整植株。（2）小黑杨单倍体悬浮细胞系Qu-1培养体系的建立:从可再生植株的单倍体愈伤组织中挑选颜色淡黄、质地松散以及生长旺盛的愈伤Qu-1作为悬浮培养的材料,通过对不同激素比例浓度的调节筛选出最适合的悬浮培养条件,结果表明,小黑杨单倍体细胞系Qu-1的最适悬浮培养基是MS+1.25 mg/L 2,4-D+ 0.2 mg/L KT+50 g/L蔗糖,pH为6.0,最佳培养温度及转数为26℃,110 rpm,最佳接种量为0.023 g/mL,培养周期为10 d。（3）小黑杨单倍体细胞系Qu-1生长特性的研究:通过与BY-2细胞系在固体培养和悬浮培养状态下的生长量,分散性以及细胞大小比较分析表明,Qu-1较BY2细胞系在悬浮培养时表现出生长速度更为旺盛且具有良好分散性等特点;同时对Qu-1细胞系进行木材组分测定和植株再生诱导,结果表明,Qu-1细胞系在悬浮培养状态下木质素总含量为8.33%,S/G 比例为3.51。经过不定芽诱导,Qu-1细胞系可以再生形成完整植株。（4）小黑杨单倍体细胞系Qu-1全基因组测序:Qu-1细胞系基因组测序采用三代PacBio和二代测序两种技术相结合的方式,依赖三代测序长读长的特点,保证更完整的基因组组装,并使用二代测序数据校正,保证组装结果更精确可靠。同时结合Hi-C等新技术,将Qu-1细胞系基因组组装到染色体水平,从而为后续分析提供精准而全面的基因组信息。最终组装得到的Qu-1细胞系基因组大小为397.9 Mb,contig N50为6.7 Mb,scaffold N50为20.6 Mb,GC含量为33.8%;最终注释的重复序列总计196,327,743 bp,占全部基因组序列的49.3%。（5）小黑杨单倍体细胞系Qu-1瞬时遗传转化体系的建立:以农杆菌介导的瞬时遗传转化操作中,通过对Qu-1细胞系瞬时遗传转化中的几个主要因素进行单因素比较试验,建立了有效的Qu-1细胞系的瞬时遗传转化体系,结果表明,将悬浮培养6 d的Qu-1细胞系与含有以水为溶剂OD600为0.2的农杆菌菌液,0.75 mM AS和0.0002 mg/L TDZ的侵染悬液在26℃,110 rpm共培养2 d时,Qu-1细胞系的瞬时遗传转化效果最好;在以原生质体介导的瞬时遗传转化操作中,选择培养8-9 d的Qu-1细胞系进行原生质体分离,原生质体得率最高,转化效率可达30～35%,利用Qu-1原生质体分离及转化系统已进行多种细胞器定位及BiFC试验。（6）小黑杨单倍体细胞系Qu-1稳定遗传转化体系的建立:对Qu-1细胞系进行过表达,RNAi抑制表达以及CRISPR/Cas9基因编辑的遗传转化试验,通过对抗性愈伤进行常规的分子检测,结果表明,抗性筛选25-30 d即可获得抗性愈伤;DNA分子水平检测显示外源基因已整合到 Qu-1 细胞系基因组上,RNA分子水平检测显示,过表达与RNAi抑制表达的目的基因在不同转基因愈伤中相对表达量存在差异;通过基因编辑获得的转基因愈伤,为纯合突变株。（7）小黑杨单倍体细胞系Qu-1响应ABA处理分析:设置不同浓度梯度ABA对Qu-1细胞系进行不同时间处理,通过对处理后Qu-1细胞系的活性检测,以及对已有报道的应答基因进行定量分析,确定最适的ABA处理浓度,从而建立Qu-1细胞系ABA处理体系。利用100 μM ABA对Qu-1细胞系处理0 h,0.5 h,4 h,12 h和24 h并进行转录组分析,结果表明Qu-1细胞系具有与已知报道的ABA相同的应答通路,鉴于其胁迫处理操作简单方便,可以作为优良的模型系统进行胁迫处理研究。综上所述,小黑杨单倍体细胞系Qu-1的获得及开发应用表明其具有巨大的潜力成为植物领域尤其是林木分子生物学研究的模式细胞系,为相关领域研究提供重要的帮助。
魏明[6]（2021）在《大青杨PuHox52响应低氮胁迫的分子机制》文中研究指明氮素营养对于植物的生长发育至关重要,植物主要通过根系吸收土壤中的氮素营养。贫瘠的土壤环境是影响林木产量的重要因素之一,因此了解林木适应低氮环境的分子机制,培育具有低氮抗性的新品种对于林业的发展具有重要的意义。已有大量的研究表明HD-ZIP蛋白家族在非生物胁迫和激素响应方面具有重要的调控作用,但HD-ZIP家族基因在低氮环境下的抗性机制鲜有报道。本研究以大青杨为研究对象,开展了 HD-Zip家族I亚族中γ分支转录因子PuHox52在根部响应低氮环境的分子机制研究。（1）实时荧光定量PCR表明,PuHox52基因在大青杨根部被低氮胁迫显着诱导,对PuHox52基因启动子驱动GUS的转基因大青杨进行组织化学染色发现,在正常生长条件下,PuHox52pro::GUS株系只在叶片中被染色,根部不被染色,在低氮胁迫后,PuHox52pro::GUS株系除了在叶片中被染色,在根部也被染色,并特异的在幼嫩侧根部位被染色。结果表明,PuHox52基因受低氮胁迫诱导,同时特异的在根中表达。（2）分别对野生型大青杨（WT）、PuHox52过表达（PuHox52-OE）和抑制表达（PuHox52-RNAi）大青杨转基因组培苗进行低氮胁迫。低氮胁迫3周后,与WT相比,PuHox52-OE株系的根部更加发达,根部生物量显着增加,增加幅度为63-70%,同时表现出主根伸长（增加25-31%）,侧根长度和密度均增加（分别增加55-58%和28-30%）,而PuHox52-RNAi株系与WT相比根部生物量下调42-48%,主根长度下降18%-19%、侧根长度和侧根密度均显着降低,分别降低36-38%和10-12%;对WT和PuHox52各转基因株系水培苗进行长期低氮胁迫60 d发现,与WT相比,过表达PuHox52株系根部发达,生物量增加25-27%,同时根部吸收NO3-的能力增强（增加22-24%）,而PuHox52-RNAi株系根部生物量与WT相比减少22-23%,吸收NO3-的能力减弱（降低18-20%）。这些结果表明,低氮胁迫后,PuHox52转录因子能够通过促进侧根的生长,提高根部对NO3-的吸收能力来抵御低氮环境。（3）对正常生长条件和低氮胁迫3周的WT和PuHox52-OE株系的叶片和根进行转录组测序,获得低氮胁迫后PuHox52-OE株系和WT在根中的差异表达基因（DEGs）3452个,其中在PuHox52-OE株系中,1914个基因上调表达,1538个基因下调表达。对这3452个DEGs进行注释分析,发现许多DEGs中显着富集的GO terms都和氮相关,包括氮利用途径,硝态氮响应、转运和合成途径,固氮作用和谷氨酰胺合成过程等,同时还发现磷酸盐响应转运相关的GO terms也显着富集。（4）为了找到PuHox52在响应低氮胁迫时直接结合的靶基因,利用酵母单杂交（Y1H）实验对PuHox52和11个氮转运途径相关的候选靶基因（PuNRT1.1、PuNRT3.1A、PuNRT3.1B、PuCLC-b、PuNIA2、PuNIR1、PuIRT、PuOCT3、PuNLP1、PuLOB37和PuGOGAT）进行验证,发现PuHox52只结合在PuNRT1.1基因的启动子区;进一步染色质免疫共沉淀（ChIP）实验,ChIP-PCR和ChIP-qPCR结果表明,PuHox52在PuNRT1.1基因的启动子区TAATTA元件附近显着富集;凝胶迁移阻滞（EMSA）实验结果表明PuHox52能够与PuNR T1.1基因启动子区TAATTA元件的特异性结合,从而直接调控PuNRT1.1表达。（5）对大青杨PuNRT1.1基因序列进行生物信息学分析,发现PuNRT1.1属于跨膜蛋白;瞬时转化原生质体实验结果表明PuNRT1.1在细胞水平上定位于液泡膜上;分别获得了 14个PuNRT1.1过表达（PuNRT1.1-OE）和10个抑制表达（PuNRT1.1-RNAi）大青杨转基因株系,对WT、PuNRT1.1-OE和PuNRT1.1-RNAi株系在正常生长条件和低氮胁迫下进行了表型分析,结果表明,过表达PuNRT1.1能够改善大青杨在低氮胁迫下的耐受性,主要表现在促进大青杨根部的生长,与WT相比根部生物量增加幅度在76.7-78.1%,同时主根与WT相比伸长12.8-12.9%,侧根长度和侧根密度显着增加,增加幅度分别为82-100%和23.9-27.4%;而PuNRT1.1-RNAi株系在低氮胁迫下与WT相比根部生物量显着下降,下降幅度为15.5-19.5%,侧根长度和侧根密度也显着降低,对低氮环境较为敏感。（6）荧光实时定量PCR检测结果发现PuHDA9在不定根发育过程和低氮胁迫前后PuHox52-OE株系根部与WT相比均显着下调。构建了 PuHDA9抑制表达载体,利用叶盘法进行大青杨遗传转化,共获得12个PuHDA9抑制表达（PuHDA9-RNAi）株系。在正常生长条件下,抑制表达PuHDA9能够促进不定根的发育,与WT相比,PuHDA9-RNAi株系的不定根数量显着增加,增加幅度在35%-38%。通过Y1H、ChIP和EMSA实验证明PuHox52能够结合PuHDA9基因的启动子区。利用H3K9ac抗体进行ChIP-seq实验,结果表明PuHox52通过抑制PuHDA9的表达,增强了 3个PuHox52直接调控的根发育相关调节因子（PuWRKY51、PuLBD21和PuIA47）TSS附近区域和编码区的H3K9乙酰化修饰水平,导致这3个关键调节因子的表达水平显着提高,从而间接增强了 PuHox52介导的不定根发育调控。随后分别对WT和PuHDA9-RNAi株系进行低氮胁迫的表型分析,发现抑制表达PuHDA9能够改善大青杨在低氮胁迫下的耐受性,在低氮胁迫下PuHDA9-RNAi株系促进大青杨根部的生长,根部生物量比WT增加83-85%。PuHDA9基因在低氮环境中的抗性可能与受PuHox52负调控,从而通过H3K9ac修饰影响根发育相关基因有关。综上所述,在低氮胁迫下,PuHox52通过调控PuNR T1.1等氮转运相关基因的表达,正向调控根的生长,提高根系对NO3-的吸收能力,从而提高大青杨在低氮胁迫下的耐受力。另一方面,PuHox52负调控PuHDA9改变基因组H3K9乙酰化修饰水平,提高根发育基因的表达促进根系的生长发育,从而改善大青杨对低氮环境下的耐受性。本研究为阐明杨树根系适应氮素匮乏土壤环境的分子机制提供了新的思路,同时为培育低氮胁迫抗性林木新品种提供了宝贵的基因资源和理论基础。
王瀚增[7]（2021）在《大青杨PuMYB40调控低磷诱导不定根发生的分子机制》文中提出根系是植物吸收磷元素的重要器官,植物根系在低磷胁迫下会通过改变其构型等方式以应对低磷胁迫。在林木中,低磷信号调控不定根发生的分子机制尚不清楚。因此,阐明林木根系响应低磷信号的分子机制具有重要理论意义和应用价值。（1）大青杨组培茎段在正常磷（200 μM KH2PO4）WPM固体培养基中预培养5天（不定根原基出现）,将茎段移至低磷（10 μM KH2PO4）WPM液体培养基培养后发现,低磷胁迫下大青杨不定根数要明显多于正常磷生长条件下的不定根数。（2）将在正常磷条件预培养5天的大青杨组培茎段低磷处理12 h,取茎基部不定根发生部位进行石蜡切片,结果发现,与正常磷处理的茎段相比,低磷胁迫的茎段产生更多的不定根原基并且出现新生的不定根原基。（3）根据前期大青杨低磷胁迫不定根表型观察结果,将正常磷条件预培养5天的大青杨组培茎段移至低磷培养基中培养。随后选择5个时间点（2 h、4 h、8 h、12 h和24 h）,取不定根原基进行转录组测序。各时间点正常磷条件下的不定根原基作为对照。转录组5个时间点共获得了 1706个差异基因,其中817个基因上调表达,889个基因下调表达。GO 富集结果表明,分子功能中“DNA-binding transcription factor activity（GO:0003700）”富集的差异基因最多;在生物进程中“response to stimulus（GO:0050896）”富集的差异基因最多。（4）根据低磷转录组差异基因GO注释共筛选出29个与根系发育、低磷胁迫响应以及生长素相关的差异基因,构建了大青杨低磷诱导不定根发生多层层级基因调控网络,筛选出位于基因调控网络高层的PuMYB40,可能参与短期低磷胁迫促进大青杨不定根发生进程。（5）同源性分析表明PuMYB40属于典型的R2R3型MYB转录因子。转录激活实验证实PuMYB40具有转录激活活性且激活区位于C端（109-282 aa）。（6）PuMYB40在短期低磷胁迫大青杨不定根发生进程中显着上调表达。通过构建PuMYB40的表达载体并稳定遗传转化大青杨,共获得了 19个PuMYB40过表达株系（PuMYB40-OE）和16个抑制表达株系（PuMYB40-SRDX）。在正常磷组培条件下,与野生型（WT）相比,PuMYB40-OE株系不定根数量显着增加,且生根时间提前。而PuMYB40-SRDX株系不定根数量明显减少,且出现生根延迟的现象。低磷胁迫下PuMYB40-SRDX株系不定根数和根系生物量低磷胁迫前后均没有显着性变化,说明PuMYB40可能参与短期低磷胁迫促进大青杨不定根发生过程。（7）我们构建的大青杨低磷诱导不定根发生多层层级基因调控网络中,PuLRP1和PuERF003都是PuMYB40和PuWRKY75的下游基因。RT-qPCR实验发现,与WT相比较,PuMYB40和PuWRKY75过表达株系中PuLRP1和PuERF003均显着上调表达,而PuMYB40和PuWRKY75抑制表达株系中PuLRP1和PuERF003均显着下调表达。进一步酵母单杂交、ChIP-qPCR和EMSA实验结果表明,PuLRP1和PuERF003都是PuMYB40和PuWRKY75直接调控的靶基因。双萤光素酶实验进一步验证了这一直接调控关系并且验证出PuMYB40与PuWRKY75互作形成的二聚体促进PuLRP1和PuERF003的转录。（8）与WT相比较,PuLRP1以及PuERF003过表达株系的不定根数显着增加,而PuLRP1以及PuERF003抑制表达株系的不定根数明显减少。PuLRP1和PuERF003抑制表达株系受低磷胁迫前后的不定根数量和根系生物量没有发生显着变化。（9）PuWRKY75属于WRKYⅡc亚族基因,在我们构建的基因调控网络中,位于高层且干涉频率仅次于PuMYB40。PuWRKY75在短期低磷胁迫促进不定根发生进程中显着上调表达。通过酵母双杂交、双分子荧光互补实验和免疫共沉淀实验表明,PuWRKY75与PuMYB40互作并且互作域分别位于PuMYB40的C端（109-252 aa）和PuWRKY75的N端（1-100aa）。与WT相比,PuWRKY75-OE株系不定根数量显着增加,抑制表达株系呈现出相反的表型。此外,PuWRKY75-SRDX株系受低磷胁迫前后的不定根数量和根系生物量没有显着性变化。本研究的实施与完成可以为杨树生根能力提高的遗传改良提供重要的理论基础和基因资源。
于磊[8]（2021）在《水曲柳DELLA家族基因应答低温胁迫及参与被动休眠调控研究》文中指出水曲柳（Fraxinus mandshurica Rupr.）属于木犀科梣属落叶乔木,是我国北方珍贵的阔叶树种,具有丰富的抗寒等抗性基因资源,同时胁迫下又会采取被动休眠的方式应对,有文献报道作为赤霉素调控通路的重要节点和负调控因子的DELLA蛋白在耐低温胁迫和诱导休眠中起到关键作用,其在水曲柳耐低温及生长的适应性选择调控研究从未报道。本研究克隆得到DELLA家族FmRGA 1/FmGAI基因及启动子序列,通过生物信息学分析、基因表达模式、转基因以及酵母双杂交等方法对其功能进行研究,解析DELLA在低温胁迫响应中的作用,阐明了DELLA基因能够提高植株抗寒耐受能力,进一步依据DELLA参与赤霉素调控生长的机制,针对水曲柳组培苗移栽后发生休眠导致的幼苗枯死、烂根等移栽障碍建立了赤霉素打破水曲柳离体再生过程中被动休眠有效解决方案,解析了赤霉素通路关键基因DELLA的表达对休眠的调控,为水曲柳组培微繁工厂化育苗技术的推广提供了坚实的保障,为我国水曲柳耐寒研究和遗传改良提供理论基础,主要研究结果如下:1、基于水曲柳转录组数据库筛选,克隆得到水曲柳DELLA家族两个成员:FmRGA1（KX905159.1）全长 1803bp,编码 600 个氨基酸;FmGAI（KX905158.1）全长 1710bp,编码569个氨基酸。保守结构域分析表明FmDELLA蛋白属于DELLA家族。同源序列比对结果显示FmRGA1蛋白与大岩桐、芝麻、烟草的进化地位更加接近,FmGAI蛋白与芝麻、本生烟、马铃薯亲缘关系更近。DELLA基因的表达模式分析结果显示,FmDELLA基因可以短时间内迅速响应低温和NaCl非生物胁迫且对于ABA、GA3、IAA、MeJA、SA和BR等6种激素信号诱导表达模式各不相同,但都具有响应。解析FmDELLA基因的时空表达模式分析得出,FmDELLA基因在水曲柳茎、叶、芽等特定的部位表达并且参与了水曲柳生长周期的调控。亚细胞定位实验结果表明FmDELLA蛋白定位在细胞核。2、FmDELLA基因过表达烟草表现出耐低温和矮化表型。从形态学差异、生理生化指标以及转录表达三个层面分析DELLA转基因烟草在低温胁迫下的功能,实验结果显示FmDELLA基因在0-4℃处理15d时长势明显优于野生型仍然保持着健康的状态,茎叶粗壮、叶片嫩绿,仍然缓慢生长;FmDELLA过表达株系体内MDA、相对电导率和细胞内ROS积累显着低于WT,抗氧化物酶系统（SOD、CAT和POD）、叶绿素、可溶性糖和脯氨酸含量显着高于WT;qRT-PCR分析显示在低温处理下转基因烟草体内多个生理相关基因、冷信号转导通路基因、次生代谢调控基因、开花基因以及激素调控通路基因均上调表达,说明FmDELLA基因过表达增加了下游靶基因的转录,进而影响烟草植株在低温胁迫中的适应性。3、通过染色体步移技术克隆得到FmRGA1基因上游启动子1669bp,FmGAI基因上游启动子1206bp。DELLA基因启动子具有CAAT-box和TATA-box核心元件,8种光诱导元件,7种激素应答元件以及低温、干早等多种非生物胁迫响应元件以及种子、根、茎等多个组织部位表达顺式作用元件。FmDELLA启动子连接GUS报告基因瞬时转化水曲柳,转基因植株GUS染色结果显示,FmDELLA基因启动子在水曲柳茎、叶柄和愈伤等位置活性较高。构建过表达载体瞬时转化水曲柳进行低温处理,对多个信号转导通路基因定量分析结果显示低温抑制赤霉素基因的表达,促进DELLA基因的累积,综上结果表明DELLA启动子具备转录起始功能,响应激素、低温等调控通路,参与多种生物途径,调控生物学过程,增强植物对外界环境的适应能力,增加植株的抗寒性。4、构建FmDELLA过表达/干扰载体瞬时转化水曲柳,经0-4℃低温处理12h后通过qPCR检测冷信号调控相关通路基因的表达水平,FmDELLA基因过表达结果表明水曲柳通过赤霉素和CBF冷信号途径增强耐低温能力。通过酵母双杂交确定DELLA蛋白与GA3、GID1、JAZ、MYBL2、XERICO、ABI5、PIF3、ICE1 等蛋白存在互作,进一步说明DELLA蛋白功能依赖于赤霉素信号途径,参与茉莉酸、脱落酸,转录因子、光和温度等信号途径,调控植物的抗逆功能。5、研究水曲柳种子和芽在休眠/解除休眠关键时期内源激素的变化得出,赤霉素、细胞分裂素和脱落酸均直接参与并调控该生物学进程,分析水曲柳种子成苗过程中GA和ABA通路关键基因的表达结果显示:FmDELLA基因的表达与XERICO、PP2C及DOG1/DOG2基因呈现相同的趋势,说明FmDELLA基因依赖GA途径并通过ABA参与休眠及生长的调控,在胚发育初期和成苗后期,FmDELLA基因的表达量显着降低,说明FmDELLA基因参与水曲柳种子休眠/解除过程中的生长调控。6、进一步解析组培微繁过程中出现的休眠现象与FmDELLA基因表达的关系,结果表明FmDELLA基因的表达在组培苗休眠时期显着高于生长时期。其中FmDELLA基因表达量在培养90d（第一次继代培养后）时达到峰值,RGA1/GAI基因表达量是对照的23.51/12.86倍,此时组培苗出现被动休眠,植株明显出现老化现象,也说明FmDELLA基因参与水曲柳休眠调控。在研究和提出水曲柳组培苗壮苗、生根、炼苗移栽技术和组培苗一步法生根与移栽简化技术前提下,基于组培微繁及移栽后出现被动休眠的现象,建立解除水曲柳组培苗移栽过程中非生理性休眠技术。7、分析在移栽休眠/解除过程中FmDELLA基因表达量的变化,结果显示FmDELLA基因在移栽培养45d时出现表达高峰,此时在休眠芽组织中RGA1/GAI基因表达量是对照的19.29/10.08倍,经GA处理后,FmDELLA基因表达量显着下降,在萌发芽中RGA1/GAI基因表达量是对照的2.34/3.19倍,分别下降了 87.87%和68.35%。说明FmDELLA基因与被动休眠密切相关,且所建立的打破休眠技术是通过调控FmDELLA基因的表达从而实现。综上,水曲柳适应胁迫的机制可能是积累FmDELLA基因产物延缓植物生长,适应和抵御外界环境的变化,通过FmDELLA调控生长与抗逆之间的平衡。
李丹丹[9]（2020）在《锌指蛋白PuC3H35调控大青杨根部应答干旱胁迫的机制研究》文中研究表明树木在森林生态系统中具有重要的经济和生态价值。干旱是影响树木生长和发育较严重的逆境因子之一。了解树木如何响应干旱,分析树木抗旱分子机制,培育抗旱新品种对未来林业的发展具有重要意义。树木根系在干旱胁迫应答过程中起着十分重要的作用,根系对干旱胁迫的响应主要包括一系列根系形态特征以及生理、生化和分子水平的变化。已有研究表明锌指蛋白转录因子在植物生长、发育、形态建成以及逆境应答中起着不同的调控作用。目前对抗旱机理的研究多数集中在地上部分,对根系的研究较少。本研究以大青杨（Populus ussuriensis）根部为研究对象,开展了 CCCH型锌指蛋白基因PuC3H35调控根部应答干旱胁迫分子机制的研究。（1）克隆全长大青杨CCCH型锌指蛋白PuC3H35,PuC3H35基因的开放阅读框为2133 bp,编码710个氨基酸,其编码的蛋白具有2个串联CCCH motifs,并含有核定位序列（NLS）、核输出信号（NES）和2个ANK蛋白。进化树分析发现PuC3H35基因属于Ⅸ亚族的第2小亚类。亚细胞定位结果发现PuC3H35蛋白定位于细胞核中;转录自激活实验发现PuC3H35具有转录激活活性,并且其转录激活区位于390-449 aa和615-710 aa 处。（2）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果表明,PuC3H35基因在大青杨根中表达量最高,在茎中最低,呈现显着的组织特异性,同时对PEG6000胁迫具有响应,在根中的诱导表达显着高于叶片。对PuC3H35基因启动子驱动GUS基因转基因大青杨的GUS染色实验发现,正常培养条件下,发现只在根部可看到明显的染色现象,渗透胁迫后,GUS染色在根中颜色更深,叶片染色很浅,与定量结果一致。（3）分别获得了PuC3H35过表达（PuC3H35-OE）和抑制表达（PuC3H35-SRDX）大青杨转基因株系。对组培苗进行6%PEG6000渗透胁迫后发现,与野生型大青杨（WT）相比,PuC3H35-OE株系的根系更发达,根部电导率（EL）、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量少,相反,与WT相比,PuC3H35-SRDX株系根部生物量小、EL、MDA和ROS含量高。对土培苗的干旱胁迫实验后发现,在长期干旱胁迫后,与WT相比,过表达株系的根部发达,木质化程度提高,而抑制表达株系根部生长受到抑制,木质化程度低。这些结果表明干旱胁迫时,PuC3H35锌指蛋白转录因子能够通过提高根部清除ROS的能力和提高根部木质化程度来抵御干旱胁迫。（4）对正常生长和6%PEG6000胁迫7天的WT和PuC3H35-OE株系根部进行转录组测序,正常生长条件下有1488个差异基因（DEGs）,其中PuC3H35-OE株系中有893个基因上调表达,595个基因下调表达;当干旱胁迫后共有1282个差异基因,其中PuC3H35-OE株系551个基因上调表达,731个基因下调表达。对差异基因进行GO功能注释发现,这些差异基因很多与代谢途径相关如类黄酮代谢过程、次生代谢过程、原花青素生物合成途径、木质素生物途径。同时与植物防胁迫和防御反应相关的GO terms如激素代谢途径、脱落酸信响应、水分运输、以及细胞分裂、细胞对过氧化氢的反应等都具有差异基因的显着富集。（5）染色质免疫共沉淀、酵母单杂交和凝胶迁移实验验证了 PuC3H35蛋白可以与原花青素合成途径中的花青素还原酶（PuANR）基因和木质素生物合成调控基因PuEARL11的启动子区相结合,从而直接调控这两个基因的表达。（6）PuANR过表达（PuANR-OE）株系促进了干旱胁迫下根部原花青素的积累和降低了根部的ROS水平,提高了转基因株系的抗旱能力,而PuANR抑制表达（PuANR-RNAi）株系降低了干旱胁迫下根部原花青素的积累,提高了根部的ROS水平,降低了转基因株系的抗旱性。同样,PuEARL11过表达株系（PuEARL11-OE）促进了干旱胁迫下根部木质素合成,提高了转基因株系的抗旱性,而该基因的RNAi抑制表达株系降低了转基因株系的木质素含量和抗旱性。综上所述,在干旱胁迫下,PuC3H35能够通过促进根部原花青素的合成,降低胁迫后根部产生的ROS,另一方面通过促进根部木质素合成来提高根部木质化程度,两种机制相辅相成,共同作用最终提高大青杨的抗旱性。本研究为理解杨树根系抗旱响应的分子机制提供了新的思路,为杨树遗传改良奠定了理论基础。
董实伟[10]（2020）在《毛果杨PtrIDP1基因的克隆及功能分析》文中指出固有无序蛋白质（Intrinsically disordered proteins,IDPs）是一类在天然状态下整体或局部不折叠,缺乏稳定三维结构,但能够正常行使生物学功能的蛋白质,它普遍存在于蛋白质组中,参与信号转导、转录调控、胁迫应答等一系列生物学过程。目前,有关木本植物IDPs在盐胁迫应答反应中的功能研究鲜有报道。本研究从毛果杨（Populus trichocarpa）中克隆PtrIDP1（Potri.010G161200.1）基因,研究了其蛋白质序列、基因的表达与功能。（1）毛果杨PtrIDP1基因完整的CDs区序列长度为423 bp,共编码140个氨基酸。该蛋白质的理论等电点（pI）为5.58,脂溶指数为58.71,总平均亲水系数为-0.716,不稳定系数为29.60,说明该蛋白为稳定的酸性亲水蛋白。系统进化树分析表明毛果杨PtrIDP1蛋白与胡杨PeIDP1亲缘关系较近。（2）利用实时定量RT-PCR技术分析了 PtrIDP1基因在毛果杨不同组织中的表达特异性和对非生物胁迫的响应表达特性,结果表明:PtrIDP1基因在毛果杨的根、茎、叶中均有表达,其中在根部表达量最低,在茎和叶中相对表达量较高;对PtrIDP1基因在干旱和盐胁迫下的表达进行分析,表明盐胁迫促进PtrIDP1的表达,PEG也能够调节PtrIDP1的表达。（3）构建亚细胞定位表达载体,瞬时转化洋葱表皮细胞,观察显示,PtrIDP1基因编码的蛋白质定位在细胞核内。（4）克隆并构建pROKⅡ-PtrIDP1植物过表达载体,采用农杆菌介导法将PtrIDP1基因转化到毛果杨中,分析PtrIDP1基因在盐胁迫应答反应中的功能。在盐胁迫下,转基因植株的株高明显高于非转基因植株;与非转基因相比,转基因植株叶绿素、SOD、POD含量均显着升高,而MDA含量下降,以上生理指标表明,PtrIDP1基因在杨树中的过量表达显着提高了转基因植株的耐盐性。综上所述,PtrIDP1基因在毛果杨盐胁迫应答反应中发挥重要的作用。
二、林木转基因工作研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、林木转基因工作研究进展（论文提纲范文）
（1）白桦BpERF1.1基因在低温、干旱和盐胁迫中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物响应非生物胁迫的研究进展 |
| 1.2.1 植物响应低温胁迫的研究进展 |
| 1.2.2 植物响应盐胁迫的研究进展 |
| 1.2.3 植物响应干旱胁迫的研究进展 |
| 1.3 转录因子 |
| 1.3.1 AP2/ERF转录因子家族 |
| 1.3.2 转录因子ERF1研究进展 |
| 1.4 白桦概述 |
| 1.5 本论文的研究目的与意义 |
| 1.6 本论文的研究内容与技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 2 白桦BpERF1.1基因的克隆及亚细胞定位 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 实验载体及菌株 |
| 2.2.3 实验试剂与酶 |
| 2.2.4 溶液及培养基配制 |
| 2.2.5 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 白桦BpERF1.1基因的克隆 |
| 2.3.2 白桦BpERF1.1基因的亚细胞定位 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 BpERF1.1基因的克隆 |
| 2.4.2 BpERF1.1基因的亚细胞定位 |
| 2.5 本章讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 白桦BpERF1.1基因的表达模式 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 植物材料及其处理 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验药品及培养基配置 |
| 3.2.4 实验仪器与器皿 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 白桦的组织培养 |
| 3.3.2 白桦的低温胁迫处理 |
| 3.3.3 白桦总RNA的提取 |
| 3.3.4 qRT-PCR模版cDNA的制备 |
| 3.3.5 BpERF1.1基因的qRT-PCR |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 BpERF1.1基因在不同组织中的表达分析 |
| 3.4.2 BpERF1.1基因在低温胁迫物胁迫下的表达模式 |
| 3.5 本章讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 白桦BpERF1.1基因过表达载体的构建与遗传转化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验载体、菌株 |
| 4.2.4 实验药品及培养基配制 |
| 4.2.5 实验仪器与器皿 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 BpERF1.1基因过表达载体(pROKII-BpERF1.1)的构建 |
| 4.3.2 过表达载体(pROKII-BpERF1.1)的表达分析 |
| 4.3.3 过表达BpERF1.1基因白桦的获得与筛选 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 BpERF1.1基因过表达载体的构建 |
| 4.4.2 过表达载体(pROKII-BpERF1.1)的表达分析 |
| 4.4.3 过表达BpERF1.1基因白桦的获得与筛选 |
| 4.5 本章讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 白桦BpERF1.1基因在非生物胁迫中的功能分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 其他材料 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 实验仪器与器皿 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 植物材料的处理 |
| 5.3.2 白桦的生理指标测定 |
| 5.3.3 过表达BpERF1.1基因白桦中差异基因的富集分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 白桦在正常条件下的表型观察 |
| 5.4.2 白桦BpERF1.1基因在低温胁迫中的功能 |
| 5.4.3 白桦BpERF1.1基因在盐胁迫中的功能 |
| 5.4.4 白桦BpERF1.1基因在干旱胁迫中的功能 |
| 5.4.5 过表达BpERF1.1基因白桦中差异基因的富集分析 |
| 5.5 本章讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学硕士学位论文修改情况确认表 |
（2）白桦BpSPL基因家族鉴定及BpSPL2基因在不定根发生中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物不定根发生的研究进展 |
| 1.2.1 不定根发生的组织解剖学特征 |
| 1.2.2 激素对不定根发生的影响 |
| 1.2.3 参与不定根发生的基因研究进展 |
| 1.3 SPL转录因子的研究进展 |
| 1.3.1 SPL转录因子结构域特征 |
| 1.3.2 SPL转录因子的表达调控 |
| 1.3.3 SPL转录因子的生物学功能 |
| 1.3.4 miR156/SPLs参与植物的根发育及不定根发生的研究现状 |
| 1.4 本研究的目的意义和技术路线 |
| 1.4.1 目的意义 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 2 BpSPL基因家族生物信息学分析和功能的初步验证 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 分子试剂与化学试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 引物合成 |
| 2.1.6 常规药品及配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 白桦BpSPLs基因家族的鉴定和进化树分析 |
| 2.2.2 白桦BpSPLs基因家族结构、保守motif分析 |
| 2.2.3 白桦miR156序列的鉴定 |
| 2.2.4 预测miR156靶向的BpSPLs |
| 2.2.5 白桦基因组DNA的提取 |
| 2.2.6 白桦组织总RNA提取及反转录 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR分析 |
| 2.2.8 miRNA的qRT-PCR分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 白桦BpSPL家族基因的鉴定 |
| 2.3.2 BpSPLs基因家族的进化分析和基因结构分析 |
| 2.3.3 白桦miR156的鉴定、结构分析及结合位点预测 |
| 2.3.4 BpSPLs基因在不同组织的表达分析 |
| 2.3.5 BpSPLs基因在雌雄花发育过程中的表达分析 |
| 2.3.6 BpSPLs基因在叶片发育过程中的表达分析 |
| 2.3.7 白桦BpSPLs基因在不定根发生过程中的表达模式分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 本章讨论 |
| 3 白桦BpSPL2基因及其启动子的功能分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 主要试剂及仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 白桦BpSPL2基因的克隆及pGWB5-BpSPL2-GFP植物表达载体构建 |
| 3.2.2 BpSPL2基因结构及保守域分析 |
| 3.2.3 BpSPL2与其它物种同源性分析 |
| 3.2.4 BpSPL2亚细胞定位分析 |
| 3.2.5 BpSPL2启动子克隆 |
| 3.2.6 植物表达载体pBI121-BpSPL2pro::GUS的构建及转化至农杆菌 |
| 3.2.7 农杆菌遗传转化至拟南芥 |
| 3.2.8 农杆菌遗传转化至白桦 |
| 3.2.9 BpSPL2pro::GUS转基因白桦的分子检测 |
| 3.2.10 GUS染色 |
| 3.2.11 石蜡切片 |
| 3.2.12 BpSPL2启动子序列元件分析 |
| 3.2.13 BpSPL2抑制表达载体构建 |
| 3.2.14 过表达载体和抑制表达载体遗传转化白桦 |
| 3.2.15 转基因白桦的鉴定 |
| 3.2.16 BpSPL2转基因植株根表型观察 |
| 3.2.17 BpSPL2转基因植株生根指标测定 |
| 3.2.18 BpSPL2转基因植株地上部分表型观察 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 BpSPL2基因克隆及基因结构、保守域分析 |
| 3.3.2 BpSPL2与其他物种的同源性分析 |
| 3.3.3 BpSPL2过表达载体的构建 |
| 3.3.4 BpSPL2亚细胞定位 |
| 3.3.5 BpSPL2启动子的获得及序列分析 |
| 3.3.6 植物表达载体pBI121-BpSPL2pro::GUS的构建 |
| 3.3.7 BpSPL2pro::GUS转基因拟南芥的获得 |
| 3.3.8 BpSPL2pro::GUS转基因白桦的获得 |
| 3.3.9 转基因拟南芥的GUS染色分析 |
| 3.3.10 转基因白桦的GUS染色分析 |
| 3.3.11 BpSPL2抑制表达载体的构建 |
| 3.3.12 BpSPL2过表达和抑制表达转基因植株检测 |
| 3.3.13 BpSPL2转基因植株根表型观察 |
| 3.3.14 BpSPL2转基因植株根的生理指标测定 |
| 3.3.15 BpSPL2转基因植株地上部分的表型观察 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 本章讨论 |
| 4 BpSPL2调控不定根的转录组测序分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.1.3 引物合成及转录组测序 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转录组材料处理 |
| 4.2.2 RNA提取、文库构建及RNA-seq |
| 4.2.3 原始序列处理和比对到基因组 |
| 4.2.4 差异表达基因分析及功能注释 |
| 4.2.5 GO和KEGG富集分析 |
| 4.2.6 qRT-PCR验证 |
| 4.2.7 BpSPL2下游靶基因预测 |
| 4.2.8 预测靶基因在转基因白桦不定根发生过程中的表达分析 |
| 4.2.9 数据处理及作图 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 总RNA质量检测 |
| 4.3.2 转录组质量评估及参考基因组的比对 |
| 4.3.3 差异表达分析 |
| 4.3.4 差异表达基因GO分类 |
| 4.3.5 差异表达基因KEGG通路富集分析 |
| 4.3.6 植物激素信号转导代谢途径差异表达基因 |
| 4.3.7 不定根发生相关基因的差异表达 |
| 4.3.8 转录组定量验证 |
| 4.3.9 下游靶基因的预测 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 本章讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（3）小黑杨单倍体愈伤悬浮培养体系建立及遗传转化PsnCYCD1;1研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 单倍体研究进展 |
| 1.2.1 花药培养途径 |
| 1.2.2 远缘杂交途径 |
| 1.2.3 单倍体诱导系诱导途径 |
| 1.3 林木单倍体育种研究进展 |
| 1.4 植物细胞悬浮培养研究进展 |
| 1.4.1 细胞悬浮培养概念和特点 |
| 1.4.2 细胞悬浮培养在林木中的应用 |
| 1.5 植物D类周期蛋白研究进展 |
| 1.6 RNA-Seq测序技术研究进展 |
| 1.6.1 RNA-Seq测序技术简介 |
| 1.6.2 转录组测序技术在植物中的应用 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 1.8 技术路线图 |
| 2 小黑杨单倍体细胞系的悬浮培养与倍性鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 常规药品及培养基配制 |
| 2.1.5 药品配制 |
| 2.1.6 悬浮培养条件单因素试验设计 |
| 2.1.7 悬浮培养条件正交设计试验 |
| 2.1.8 悬浮单倍体细胞系生长曲线的绘制 |
| 2.1.9 流式细胞术倍性鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 植物生长调节剂对单倍体细胞系生长的影响 |
| 2.2.2 蔗糖浓度对细胞系生长的影响 |
| 2.2.3 接种量对细胞系生长的影响 |
| 2.2.4 正交试验结果分析 |
| 2.2.5 单倍体细胞系生长曲线绘制 |
| 2.2.6 流式细胞术倍性分析 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 CYCD1;1基因过表达载体构建及小黑杨单倍体遗传转化 |
| 3.1 试验材料与仪器 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.1.5 常规药品及培养基配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 引物的设计与合成 |
| 3.2.2 小黑杨PsnCYCD1;1基因克隆 |
| 3.2.3 小黑杨pROKⅡ-PsnCYCD1;1过表达载体的构建 |
| 3.2.4 单倍体细胞系遗传转化 |
| 3.2.5 抗性单倍体细胞系DNA检测 |
| 3.2.6 抗性愈伤组织在RNA水平上的检测 |
| 3.2.7 单倍体细胞差异比较 |
| 3.2.8 转基因单倍体细胞系生长曲线绘制 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 pROKⅡ-PsnCYCD1;1植物过表达载体构建 |
| 3.3.2 转基因单倍体愈伤组织获得与检测 |
| 3.3.3 细胞大小比较 |
| 3.3.4 转基因细胞系生长量变化 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 转录组测序分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 试验耗材及试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 小黑杨转基因愈伤组织RNA的提取 |
| 4.2.2 转录组测序试验 |
| 4.2.3 PsnCYCD1;1下游基因的表达分析 |
| 4.2.4 荧光定量PCR验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 数据的筛选、比对和质控 |
| 4.3.2 转录因子分析 |
| 4.3.3 差异表达基因数量统计 |
| 4.3.4 差异基因GO功能分类和富集分析 |
| 4.3.5 差异基因KEGG分类和富集分析 |
| 4.3.6 qRT-PCR验证 |
| 4.3.7 PsnCYCD1;1下游基因定量检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）PtrCAld5H2和PtrCOMT2基因在84K杨中的共同遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题研究背景 |
| 1.2 木质素 |
| 1.2.1 木质素的组成 |
| 1.2.2 木质素单体的合成途径及木质素单体的聚合 |
| 1.2.3 木质素单体合成调控的研究 |
| 1.2.4 木质素的应用 |
| 1.3 CAld5H2与COMT2基因的研究进展 |
| 1.4 双价载体的研究进展 |
| 1.5 转基因杨树的研究进展 |
| 1.6 本研究目的及意义 |
| 2 毛果杨PtrCAld5H2和PtrCOMT2基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 溶液及培养基配制 |
| 2.1.5 引物合成与测序 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 CTAB法提取毛果杨RNA |
| 2.2.2 毛果杨cDNA的合成 |
| 2.2.3 毛果杨PtrCAld5H2和PtrCOMT2基因的克隆 |
| 2.2.4 胶回收PCR产物 |
| 2.2.5 pEASY-T1与PtrCAld5H2和PtrCOMT2的连接 |
| 2.2.6 pEASY-T1-PtrCAld5H2与pEASY-T1 -PtrCOMT2的检测 |
| 2.2.7 PtrCAld5H2和PtrCOMT2基因的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PtrCAld5H2和PtrCOMT2的克隆及其编码的氨基酸序列分析 |
| 2.3.2 PtrCAld5H2和PtrCOMT2基因生物信息学分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 PtrCAld5H2和PtrCOMT2植物表达载体的构建和84K杨的遗传转化 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株及载体 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 构建单价表达载体 |
| 3.2.2 双价过表达载体的构建 |
| 3.2.3 PtrCAld5H2和PtrCOMT2在84K杨中的遗传转化及分子检测 |
| 3.2.4 PtrCAld5H2和PtrCOMT2转基因抗性84K杨植株的分子检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 构建单价表达载体 |
| 3.3.2 构建双价过表达载体 |
| 3.3.3 pROK Ⅱ-PtrCAld5H2/PtrCOMT2转基因84K杨的获得 |
| 3.3.4 pROK Ⅱ-PtrCAld5H2/PtrCOMT2转基因84K杨的分子检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 PtrCAld5H2和PtrCOMT2基因在84K杨中的功能分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PtrCAld5H2和PtrCOMT2转基因植株株高分析 |
| 4.2.2 PtrCAld5H2和PtrCOMT2转基因植株地茎分析 |
| 4.2.3 PtrCAld5H2和PtrCOMT2相关基因的表达分析 |
| 4.2.4 PtrCAld5H2和PtrCOMT2转基因茎段间苯植株间苯三酚染色 |
| 4.2.5 PtrCAld5H2和PtrCOMT2转基因植株木质素含量的检测与分析 |
| 4.2.6 PtrCAld5H2和PtrCOMT2转基因植株木质素单体含量的检测与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PtrCAld5H2和PtrCOMT2转基因植株株高分析 |
| 4.3.2 PtrCAd5H2和PtrCOMT2转基因植株地茎分析 |
| 4.3.3 PtrCAld5H2和PtrCOMT2相关基因的表达 |
| 4.3.4 PtrCAld5H2和PtrCOMT2转基因茎段间苯植株间苯三酚染色 |
| 4.3.5 PtrCAldH2和PtrCOMT2转基因植株木质素含量的检测与分析 |
| 4.3.6 PtrCAld5H2和PtrCOMT2转基因植株木质素单体含量的检测与分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学硕士学位论文修改情况确认表 |
（5）小黑杨单倍体悬浮细胞筛选体系的建立及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.2.1 HeLa细胞系 |
| 1.2.2 植物细胞系 |
| 1.3 植物单倍体的研究进展 |
| 1.3.1 植物单倍体的获得过程和方法 |
| 1.3.2 植物单倍体的鉴定方法 |
| 1.3.3 植物单倍体的重要应用价值 |
| 1.4 杨树单倍体研究进展 |
| 1.5 杨树基因组研究进展 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 主要研究内容及技术路线 |
| 1.7.1 主要研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 2 小黑杨单倍体愈伤组织诱导及再生体系的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验耗材及试剂材料 |
| 2.1.3 实验仪器设备 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.1.5 培养基配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小黑杨单倍体愈伤组织的诱导 |
| 2.2.2 小黑杨单倍体愈伤组织的鉴定 |
| 2.2.3 小黑杨单倍体愈伤组织再生植株的诱导 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小黑杨单倍体愈伤诱导体系的建立 |
| 2.3.2 小黑杨单倍体愈伤组织的获得 |
| 2.3.3 小黑杨单倍体愈伤组织再生植株诱导体系的建立 |
| 2.4 本章讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 小黑杨单倍体细胞系Qu-1的获得及生长特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验耗材及试剂材料 |
| 3.1.3 实验仪器设备 |
| 3.1.4 实验试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 小黑杨单倍体细胞系Qu-1悬浮培养体系的建立 |
| 3.2.2 小黑杨单倍体细胞系Qu-1的生长特性分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小黑杨单倍体细胞系培养体系的建立 |
| 3.3.2 小黑杨单倍体细胞系Qu-1的生长特性研究 |
| 3.4 本章讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 小黑杨单倍体细胞系Qu-1全基因组测序 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 材料测序 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 DNA提取 |
| 4.2.2 DNA建库测序 |
| 4.2.3 RNA提取及测序 |
| 4.2.4 Hi-C建库及测序 |
| 4.2.5 DNA数据清洗和过滤 |
| 4.2.6 RNA数据清洗和过滤 |
| 4.2.7 k-mer分析及基因组评估 |
| 4.2.8 基因组组装及挂载 |
| 4.2.9 重复序列查找 |
| 4.2.10 非编码RNA结构注释 |
| 4.2.11 编码基因结构注释 |
| 4.2.12 编码基因功能注释 |
| 4.2.13 基因组可视化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 数据质控与统计 |
| 4.3.2 k-mer分析及基因组评估 |
| 4.3.3 基因组的组装与挂载 |
| 4.3.4 基因组中基因结构与功能注释 |
| 4.3.5 基因组可视化 |
| 4.4 本章讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 小黑杨单倍体细胞系Qu-1瞬时遗传转化体系的建立 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 载体质粒和感受态 |
| 5.1.3 实验耗材及试剂材料 |
| 5.1.4 实验仪器设备 |
| 5.1.5 实验试剂配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小黑杨单倍体细胞系Qu-1农杆菌瞬时遗传转化体系的建立 |
| 5.2.2 小黑杨单倍体细胞系Qu-1原生质体分离及转化 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 小黑杨单倍体细胞系Qu-1的农杆菌瞬时遗传转化结果观察 |
| 5.3.2 小黑杨单倍体细胞系Qu-1原生质体分离及转化 |
| 5.4 本章讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 小黑杨单倍体细胞系Qu-1稳定遗传转化体系的建立 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 载体质粒和感受态 |
| 6.1.3 实验耗材及试剂材料 |
| 6.1.4 实验仪器设备 |
| 6.1.5 实验试剂配制 |
| 6.1.6 培养基配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 基因克隆及植物表达载体的构建 |
| 6.2.2 农杆菌介导的小黑杨单倍体细胞系Qu-1的稳定遗传转化 |
| 6.2.3 转基因植株的鉴定 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 基因克隆及植物表达载体的构建 |
| 6.3.2 转基因愈伤组织的鉴定 |
| 6.4 本章讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 小黑杨单倍体细胞系Qu-1响应ABA处理RNA-seq分析 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 植物材料 |
| 7.1.2 实验耗材及试剂材料 |
| 7.1.3 实验试剂配制 |
| 7.1.4 实验仪器设备 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 小黑杨单倍体细胞系Qu-1 ABA处理体系的建立 |
| 7.2.2 小黑杨单倍体细胞系Qu-1响应ABA处理 |
| 7.2.3 转录组数据分析 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 小黑杨单倍体细胞系Qu-1 ABA处理体系的建立 |
| 7.3.2 RNA样品质检 |
| 7.3.3 转录组数据分析 |
| 7.4 本章讨论 |
| 7.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（6）大青杨PuHox52响应低氮胁迫的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物氮素营养吸收转运和同化 |
| 1.2.1 植物对氮的吸收和转运 |
| 1.2.2 植物对氮的同化 |
| 1.3 植物硝态氮对生长发育的影响 |
| 1.3.1 硝态氮对根系形态的影响 |
| 1.3.2 硝态氮对侧根发育的影响 |
| 1.3.3 硝态氮对地上部生长的影响 |
| 1.4 植物应答低氮胁迫的转录调控研究 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 2 PuHox52转基因大青杨在低氮胁迫下的抗性分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3 溶液及培养基制备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PuHox52基因在低氮胁迫下的表达分析 |
| 2.2.2 PuHox52启动子在低氮胁迫下GUS活性分析 |
| 2.2.3 减似52转基因大青杨组培苗在低氮胁迫下的表型观察和根部相关指标分析 |
| 2.2.4 PuHox52转基因大青杨水培苗在长期低氮胁迫下的生长性状分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PuHox52基因在低氮胁迫下的表达分析 |
| 2.3.2 PuHox52启动子的表达分析 |
| 2.3.3 PuHox52过表达和抑制表达对低氮胁迫下大青杨组培苗生长的影响 |
| 2.3.4 PuHox52过表达和抑制表达对大青杨水培苗在低氮胁迫下的生长和氮吸收的影响 |
| 2.4 本章讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 转录组测序分析低氮胁迫下PuHox52调控的下游基因 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 溶液及培养基配置 |
| 3.1.4 引物合成与转录组测序 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 大青杨处理和RNA提取 |
| 3.2.2 转录组测序 |
| 3.2.3 转录组数据的分析 |
| 3.2.4 RT-qPCR验证 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 RNA-seq数据的质量评估 |
| 3.3.2 WT和PuHox52-OE株系差异表达基因筛选 |
| 3.3.3 差异基因的功能分类 |
| 3.3.4 RT-qPCR验证转录组数据 |
| 3.4 本章讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 PuHox52靶基因的筛选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株与载体 |
| 4.1.3 主要试剂及仪器 |
| 4.1.4 溶液及培养基的制备 |
| 4.1.5 引物设计、合成及测序 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PuHox52候选靶基因启动子的克隆 |
| 4.2.2 酵母单杂交实验验证 |
| 4.2.3 染色质免疫共沉淀实验验证 |
| 4.2.4 凝胶迁移实验验证PuHox52结合元件 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 靶基因的酵母单杂交实验结果验证 |
| 4.3.2 靶基因的染色质免疫共沉淀实验验证 |
| 4.3.3 靶基因的凝胶迁移实验验证 |
| 4.3.4 PuHox52抑制表达株系中靶基因PuNRT1.1的表达情况 |
| 4.4 本章讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 PuHox52靶基因PuNRT1.1响应低氮胁迫功能验证 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株与载体 |
| 5.1.3 主要试剂及仪器 |
| 5.1.4 溶液和培养基配置 |
| 5.1.5 引物设计、合成及测序 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 大青杨PuNRT1.1生物信息学分析 |
| 5.2.2 PuNRT1.1亚细胞定位 |
| 5.2.3 PuNRT1.1过表达和抑制表达载体的构建 |
| 5.2.4 根癌农杆菌介导的大青杨遗传转化 |
| 5.2.5 PuNRT1.1过表达和抑制表达转基因株系的获得和分子检测 |
| 5.2.6 低氮胁迫下PuNRT1.1过表达和抑制表达株系表型和生理指标分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 PuNRT1.1基因序列及蛋白特征分析 |
| 5.3.2 PuNRT1.1蛋白多序列比对及系统进化树分析 |
| 5.3.3 PuNRT1.1亚细胞定位 |
| 5.3.4 PuNRT1.1基因在低氮胁迫下的表达模式 |
| 5.3.5 PuNRT1.1过表达和抑制表达载体的构建和转基因大青杨的获得 |
| 5.3.6 低氮胁迫下PuNRT1.1过表达和抑制表达株系的表型分析 |
| 5.4 本章讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 PuHox52靶基因PuHDA9调控不定根发育和响应低氮胁迫功能分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 菌株与载体 |
| 6.1.3 主要试剂及仪器 |
| 6.1.4 免疫印迹实验药品配置 |
| 6.1.5 引物设计、合成和测序 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 PuHDA9在低氮胁迫下和不定根发育过程的表达模式分析 |
| 6.2.2 PuHox52靶基因PuHDA9的体内和体外实验验证 |
| 6.2.3 组蛋白去乙酰化酶活性测定 |
| 6.2.4 H3K9ac抗体蛋白质免疫分析 |
| 6.2.5 H3K9ac抗体ChIP-seq实验 |
| 6.2.6 PuHDA9-RNAi载体构建和转基因大青杨的获得 |
| 6.2.7 低氮胁迫下PuHDA9转基因大青杨的表型观察和指标测定 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 PuHDA9在不定根发育过程中和低氮胁迫下的表达模式 |
| 6.3.2 体内和体外实验验证PuHox52直接调控PuHDA9 |
| 6.3.3 PuHox52通过PuHDA9调控靶基因的H3K9ac修饰水平 |
| 6.3.4 PuHDA9-RNAi载体构建和转基因株系获得 |
| 6.3.5 PuHDA9抑制表达促进大青杨不定根发生 |
| 6.3.6 低氮胁迫下PuHDA9转基因大青杨的表型观察和指标测定 |
| 6.4 本章讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（7）大青杨PuMYB40调控低磷诱导不定根发生的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物不定根发生及发育的研究进展 |
| 1.2.1 植物根系的形态结构 |
| 1.2.2 植物不定根发生及发育进程 |
| 1.3 植物激素对不定根发生发育的作用 |
| 1.4 植物根系发育及发生的分子机制研究进展 |
| 1.5 植物根系响应低磷胁迫适应性机制的研究进展 |
| 1.5.1 植物根系应对低磷胁迫的生物化学反应 |
| 1.5.2 植物根系应对低磷胁迫的生理反应 |
| 1.5.3 低磷胁迫对植物不定根和侧根发生的影响 |
| 1.6 植物响应低磷胁迫转录调控机制的研究进展 |
| 1.6.1 A basic helix-loop-helix (bHLH)转录因子对低磷的响应 |
| 1.6.2 WRKY转录因子对低磷的响应 |
| 1.6.3 ZAT转录因子对低磷的响应 |
| 1.6.4 ARF转录因子对低磷的响应 |
| 1.7 MYB转录因子 |
| 1.7.1 MYB转录因子概述 |
| 1.7.2 MYB转录因子对低磷胁迫的响应 |
| 1.8 本研究目的及意义 |
| 2 短期低磷胁迫促进大青杨不定根发生 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3 药品及培养基的配制 |
| 2.1.4 引物设计、合成及转录组测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 低磷胁迫处理野生型大青杨 |
| 2.2.2 石蜡切片 |
| 2.2.3 大青杨RNA提取 |
| 2.2.4 转录组测序分析 |
| 2.2.5 RT-qPCR验证转录组测序结果 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 短期低磷胁迫促进大青杨不定根发生 |
| 2.3.2 转录组测序数据评估 |
| 2.3.3 差异基因分析 |
| 2.3.4 差异表达基因Gene Ontology富集分析 |
| 2.3.5 RT-qPCR验证转录组测序结果分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 大青杨PuMYB40对低磷诱导不定根发生的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 主要试剂及仪器 |
| 3.1.4 药品及培养基配制 |
| 3.1.5 引物设计、合成及测序 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 大青杨低磷诱导不定根发生多层层级基因调控网络的构建 |
| 3.2.2 大青杨PuMYB40基因的克隆 |
| 3.2.3 PuMYB40生物信息学分析 |
| 3.2.4 PuMYB40转录激活活性分析 |
| 3.2.5 PuMYB40表达载体构建 |
| 3.2.6 质粒DNA转化农杆菌感受态(液氮法)及阳性重组子检测 |
| 3.2.7 大青杨基因组DNA提取 |
| 3.2.8 大青杨稳定遗传转化及转基因株系的分子检测 |
| 3.2.9 PuMYB40转基因株系不定根表型观察及生理指标测定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 大青杨低磷诱导不定根发生多层层级基因调控网络的构建 |
| 3.3.2 大青杨PuMYB40基因的获得 |
| 3.3.3 PuMYB40在短期低磷胁迫促进大青杨不定根发生进程中的表达模式 |
| 3.3.4 PuMYB40在生长素抑制剂处理下的表达分析 |
| 3.3.5 PuMYB40生物信息学分析 |
| 3.3.6 PuMYB40转录激活活性检测 |
| 3.3.7 PuMYB40表达载体构建 |
| 3.3.8 PuMYB40表达载体农杆菌阳性重组子获得及检测 |
| 3.3.9 PuMYB40转基因株系的获得及分子检测 |
| 3.3.10 PuMYB40转基因株系根表型观察及生理指标测定 |
| 3.3.11 PuMYB40转基因株系低磷胁迫生物量测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 PuMYB40下游靶基因的鉴定及功能验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株及载体 |
| 4.1.3 主要试剂及仪器 |
| 4.1.4 溶液及培养基配制 |
| 4.1.5 引物设计、合成及测序 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PuLRP1与PuERF003启动子克隆 |
| 4.2.2 酵母单杂交实验 |
| 4.2.3 EMSA验证PuMYB40结合元件 |
| 4.2.4 染色质免疫共沉淀实验 |
| 4.2.5 大青杨PuLRP1与PuERF003基因克隆 |
| 4.2.6 PuLRP1与PuERF003表达载体构建 |
| 4.2.7 PuLRP1与PuERF003稳定遗传转化大青杨 |
| 4.2.8 PuLRP1与PuERF003转基因株系筛选与分子检测 |
| 4.2.9 PuLRP1和PuERF003转基因株系根表型观察及生理指标测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PuLRP1和PuERF003启动子克隆 |
| 4.3.2 Y1H结果分析 |
| 4.3.3 ChIP结果分析 |
| 4.3.4 EMSA结果分析 |
| 4.3.5 大青杨PuLRP1与PuERF003基因的获得 |
| 4.3.6 PuLRP1和PuERF003在短期低磷胁迫促进大青杨不定根发生进程中的表达模式分析 |
| 4.3.7 PuLRP1和PuERF3在生长素抑制剂处理下的表达模式分析 |
| 4.3.8 靶基因表达载体构建及转基因株系筛选及分子检测 |
| 4.3.9 靶基因转基因株系不定根表型及根数统计 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 PuWRKY75参与低磷诱导不定根发生 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株与载体 |
| 5.1.3 主要试剂及仪器 |
| 5.1.4 溶液及培养基配制 |
| 5.1.5 Y1H主要药品配制 |
| 5.1.6 EMSA主要药品配制 |
| 5.1.7 ChIP主要药品配制 |
| 5.1.8 引物设计、合成及测序 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 大青杨PuWRKY75表达载体构建 |
| 5.2.2 酵母单杂交实验 |
| 5.2.3 凝胶迁移实验 |
| 5.2.4 染色质免疫共沉淀实验 |
| 5.2.5 PuWRKY75稳定遗传转化大青杨及阳性转基因株系筛选 |
| 5.2.6 PuWRKY75转基因株系根表型观察及生理指标测定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PuWRKY75基因克隆 |
| 5.3.2 PuWRKY75在低磷诱导不定根发生进程中的表达模式 |
| 5.3.3 PuWRKY75在生长素抑制剂处理下的表达模式分析 |
| 5.3.4 PuWRKY75生物信息学分析 |
| 5.3.5 Y1H结果分析 |
| 5.3.6 ChIP结果分析 |
| 5.3.7 EMSA结果分析 |
| 5.3.8 PuWRKY75抑制表达载体的构建 |
| 5.3.9 PuWRKY75表达载体农杆菌阳性重组子获得及检测 |
| 5.3.10 PuWRKY75转基因株系的获得和分子检测 |
| 5.3.11 PuWRKY75转基因株系根表型观察及生理指标测定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 PuMYB40与PuWRKY75互作 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 菌株与载体 |
| 6.1.3 主要试剂与仪器 |
| 6.1.4 溶液及培养基配制 |
| 6.1.5 引物设计、合成及测序 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 酵母双杂交检测PuMYB40与PuWRKY75互作 |
| 6.2.2 双分子荧光互补实验检测PuMYB40与PuWRKY75互作 |
| 6.2.3 免疫共沉淀实验检测PuMYB40与PuWRKY75互作 |
| 6.2.4 双荧光素酶实验检测PuMYB40与PuWRKY75互作 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 PuMYB40与PuWRKY75酵母双杂交实验结果分析 |
| 6.3.2 PuMYB40与PuWRKY75双分子荧光互补实验结果分析 |
| 6.3.3 PuMYB40与PuWRKY75免疫共沉淀实验结果分析 |
| 6.3.4 PuMYB40与PuWRKY75双荧光素酶实验结果分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（8）水曲柳DELLA家族基因应答低温胁迫及参与被动休眠调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物响应低温胁迫的应答 |
| 1.3 林木休眠调控研究简介 |
| 1.4 高等植物中DELLA蛋白研究进展 |
| 1.4.1 DELLA蛋白的结构和修饰 |
| 1.4.2 DELLA蛋白参与多种激素信号转导 |
| 1.4.3 DELLA蛋白在非生物胁迫下的研究 |
| 1.4.4 DELLA蛋白在植物生长发育中的研究 |
| 1.5 水曲柳无性繁殖技术研究现状 |
| 1.6 研究的目的意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 FmDELLA家族基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 水曲柳DELLA家族基因鉴定 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 cDNA的合成 |
| 2.2.4 水曲柳DELLA基因编码区的克隆 |
| 2.2.5 目的基因与pEAZY-T5载体连接与转化 |
| 2.2.6 DELLA蛋白生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 FmDELLA基因的克隆 |
| 2.3.2 蛋白结构分析 |
| 2.3.3 DELLA的系统进化分析 |
| 2.3.4 DELLA蛋白生物信息学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 FmDELLA基因的表达特征及抗寒功能分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 水曲柳DELLA基因的非生物胁迫与激素诱导表达分析 |
| 3.2.2 水曲柳DELLA基因的时空表达分析 |
| 3.2.3 实时荧光定量PCR反应 |
| 3.2.4 DELLA蛋白亚细胞定位 |
| 3.2.5 表达载体的构建 |
| 3.2.6 三亲杂交法制备农杆菌 |
| 3.2.7 农杆菌介导的本氏烟草遗传转化 |
| 3.2.8 转基因本氏烟草鉴定及扩繁 |
| 3.2.9 转基因烟草耐低温分析 |
| 3.2.10 转基因烟草生理生化测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 FmDELLA基因的表达模式分析 |
| 3.3.2 FmDELLA蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3.3 FmDELLA基因植物表达载体构建 |
| 3.3.4 FmDELLA转基因烟草植株的鉴定及表型分析 |
| 3.3.5 FmDELLA过表达烟草植株的抗寒分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 FmDELLA启动子克隆及抗寒功能分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 水曲柳基因组DNA提取 |
| 4.2.2 水曲柳DELLA基因的启动子克隆 |
| 4.2.3 启动子元件预测 |
| 4.2.4 启动子活性及表达分析 |
| 4.2.5 启动子和基因共转化抗寒功能分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 FmDELLA基因启动子的克隆 |
| 4.3.2 FmDELLA启动子生物信息学分析 |
| 4.3.3 FmDELLA启动子表达载体构建 |
| 4.3.4 FmDELLA启动子活性检测 |
| 4.3.5 FmDELLA启动子和基因共转化水曲柳的抗寒转录分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 FmDELLA应答低温调控及互作蛋白研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 过表达DELLA瞬时转化水曲柳 |
| 5.2.2 RNAi干扰载体的构建 |
| 5.2.3 酵母感受态的制备 |
| 5.2.4 诱饵载体转化酵母感受态 |
| 5.2.5 诱饵载体毒性与自激活检测 |
| 5.2.6 阳性克隆及验证 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 FmDELLA过表达载体构建及瞬时转化水曲柳 |
| 5.3.2 FmDELLA抑制表达载体构建 |
| 5.3.3 FmDELLA瞬时转化水曲柳的表达分析 |
| 5.3.4 在低温胁迫下转基因水曲柳冷调控相关基因的表达分析 |
| 5.3.5 FmDELLA与FmJAZs在低温调控中的表达研究 |
| 5.3.6 FmDELLA蛋白与低温相关通路蛋白的互作 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 DELLA介导GA在水曲柳休眠及生长的调控研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 植物内源激素提取和分析 |
| 6.2.2 水曲柳种子消毒及组培微繁 |
| 6.2.3 水曲柳组培苗生根培养 |
| 6.2.4 水曲柳组培苗移栽 |
| 6.2.5 外源喷施赤霉素解除水曲柳移栽苗顶芽休眠 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 水曲柳休眠关键时期内源激素含量变化与GA的作用分析 |
| 6.3.2 FmDELLA基因在水曲柳种子成苗过程中的表达模式 |
| 6.3.3 组培微繁中的休眠现象与DELLA基因的表达 |
| 6.3.4 水曲柳组培微繁苗木的壮苗生根与移栽技术 |
| 6.3.5 移栽苗的休眠现象与解除休眠技术的建立 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（9）锌指蛋白PuC3H35调控大青杨根部应答干旱胁迫的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物对干旱胁迫的响应机制 |
| 1.2.1 渗透调节 |
| 1.2.2 抗氧化系统 |
| 1.2.3 植物激素 |
| 1.2.4 木质素 |
| 1.2.5 分子响应机制 |
| 1.3 干旱胁迫下根系的响应 |
| 1.4 CCCH锌指蛋白的研究进展 |
| 1.4.1 锌指蛋白简介 |
| 1.4.2 CCCH锌指蛋白结构 |
| 1.4.3 第Ⅸ亚族CCCH型锌指蛋白的生物学功能 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 2 大青杨PuC3H3-基因和启动子的表达研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 实验试剂(盒) |
| 2.1.4 溶液及培养基的配置 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大青杨PuC3H35基因的克隆 |
| 2.2.2 大青杨PuC3H35基因表达模式分析 |
| 2.2.3 PuC3H35基因启动子的克隆及表达载体的构建 |
| 2.2.4 农杆菌介导法转化大青杨 |
| 2.2.5 PuC3H35基因启动子表达分析 |
| 2.2.6 PuC3H35基因启动子元件分析 |
| 2.2.7 PuC3H35基因生物信息学分析 |
| 2.2.8 PuC3H35亚细胞定位 |
| 2.2.9 PuC3H35转录活性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 大青杨PuC3H35基因的获得 |
| 2.3.2 大青杨PuC3H35基因表达模式分析 |
| 2.3.3 大青杨PuC3H35启动子的获得及转基因检测 |
| 2.3.4 PuC3H35多列比对及结构分析 |
| 2.3.5 PuC3H35进化树分析 |
| 2.3.6 PuC3H35亚细胞定位 |
| 2.3.7 PuC3H35转录激活区的确定 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 本章讨论 |
| 3 PuC3H35转基因植株的获得及功能分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 主要试剂(盒)及仪器 |
| 3.1.4 溶液及培养基的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PuC3H35过表达载体构建 |
| 3.2.2 pBI121-PuC3H35-SRDX表达载体构建 |
| 3.2.3 PuC3H35过表达及PuC3H35-SRDX表达载体遗传转化大青杨 |
| 3.2.4 PuC3H35转基因大青杨的筛选与检测 |
| 3.2.5 干旱胁迫下PuC3H35转基因组培苗抗旱生理分析 |
| 3.2.6 干旱胁迫下PuC3H35转基因大青杨土培苗生理分析 |
| 3.2.7 石蜡切片 |
| 3.2.8 木质素含量的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 过表达载体pBI121-PuC3H35-GFP的获得 |
| 3.3.2 pBI121-PuC3H35-SRDX(PuC3H35-SRDX)载体的获得 |
| 3.3.3 pBI121-PuC3H35和pBI121-PuC3H35-SRDX转化农杆菌 |
| 3.3.4 PuC3H35过表达转基因植株的筛选与检测 |
| 3.3.5 PuC3H35-SRDX转基因植株的筛选与检测 |
| 3.3.6 干旱胁迫后PuC3H35转基因大青杨组培苗生理分析 |
| 3.4 干旱胁迫后PuC3H35转基因土培苗表型观察及生理分析 |
| 3.4.1 短期干旱胁迫PuC3H5-OE和PuC3H5-SRDX株系的表型分析 |
| 3.4.2 长期干旱胁迫PuC3H5-OE和PuC3H5-SRDX株系的表型分析 |
| 3.5 本章小节 |
| 3.6 本章讨论 |
| 4 PuC3H35调控下游基因的分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 药品及试剂(盒) |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 药品配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转录组测序 |
| 4.2.2 QRT-PCR验证转录组数据 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转录组测序结果评估 |
| 4.3.2 差异基因的鉴定 |
| 4.3.3 GO分类结果 |
| 4.3.4 QRT-PCR验证转录组数据结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 本章讨论 |
| 5 PuC3H35下游靶基因的筛选和验证 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株与载体 |
| 5.1.3 主要试剂及仪器 |
| 5.1.4 溶液及培养基的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 染色质免疫共沉淀实验 |
| 5.2.2 酵母单杂交实验 |
| 5.2.3 凝胶迁移实验验证PuC3H35结合元件 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 PuC3H35下游基因启动子CT-rich元件预测 |
| 5.3.2 染色质免疫共沉淀验证PuC3H35下游靶基因 |
| 5.3.3 酵母单杂交实验结果分析 |
| 5.3.4 凝胶迁移实验结果分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 5.5 本章讨论 |
| 6 PuANR和PuEARLI1基因功能的验证 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 载体与菌株 |
| 6.1.3 溶液及培养基的配制 |
| 6.1.4 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 PuANR和PuEARLI1基因的克隆 |
| 6.2.2 PuANR和PuEARLI1表达载体的构建 |
| 6.2.3 PuANR和PuEARLI1过表达和抑制表达转基因株系的获得和检测 |
| 6.2.4 干旱胁迫下PuANR转基因组培苗表型和生理分析 |
| 6.2.5 干旱胁迫下PuEARLI1转基因组培苗表型和生理分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 PuANR和PuEARLI1基因的克隆 |
| 6.3.2 PuANR和PuEARLI1表达载体的构建 |
| 6.3.3 PuANR和PuEARLI1过表达和抑制表达转基因株系的获得及鉴定 |
| 6.3.4 干旱胁迫下PuANR转基因组培苗的表型和生化指标 |
| 6.3.5 干旱胁迫下PuEARLI1转基因表型和木质素含量的测定 |
| 6.4 本章小结 |
| 6.5 本章讨论 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（10）毛果杨PtrIDP1基因的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物耐盐研究进展 |
| 1.3 杨树的研究进展 |
| 1.3.1 杨树生物学特性 |
| 1.3.2 杨树生物与非生物胁迫研究进展 |
| 1.3.3 杨树耐盐机理的研究进展 |
| 1.4 固有无序蛋白质的研究进展 |
| 1.4.1 固有无序蛋白的分类及其特点 |
| 1.4.2 固有无序蛋白的功能 |
| 1.4.3 固有无序蛋白作用机理 |
| 1.5 PtrIDP1基因研究进展 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 毛果杨PtrIDP1基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 溶液及培养基配制 |
| 2.1.5 引物合成与测序 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 CTAB法提取毛果杨RNA |
| 2.2.2 毛果杨cDNA的合成 |
| 2.2.3 PtrIDP1基因的克隆 |
| 2.2.4 胶回收PCR产物 |
| 2.2.5 构建pROKⅡ-PtrIDP1过表达载体 |
| 2.2.6 pROKⅡ-PtrIDP1重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.7 阳性克隆PCR检测 |
| 2.2.8 PtrIDP1基因的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 毛果杨总RNA的提取 |
| 2.3.2 PtrIDP1基因克隆 |
| 2.3.3 PtrIDP1基因与pROKⅡ载体双酶切 |
| 2.3.4 pROKⅡ-PtrIDP1菌液PCR |
| 2.3.5 PtrIDP1基因生物信息学分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 PtrIDP1基因表达特性分析及亚细胞定位 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 PtrIDP1基因的组织特异性表达检测 |
| 3.2.2 PtrIDP1基因在NaCl和PEG胁迫下的表达特性分析 |
| 3.2.3 毛果杨总RNA的提取及cDNA合成 |
| 3.2.4 PtrIDP1蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PtrIDP1基因的组织表达特性 |
| 3.3.2 PtrIDP1基因在NaCl胁迫下的表达 |
| 3.3.3 PtrIDP1基因在PEG胁迫下的表达 |
| 3.3.4 PtrIDP1蛋白质亚细胞定位分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 PtrIDP1基因遗传转化毛果杨及其功能分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 试验菌种 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要溶液配置 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 使用电击法转化农杆菌感受态细胞(EHA105) |
| 4.2.2 pROKⅡ-PtrIDP1重组农杆菌阳性克隆鉴定 |
| 4.2.3 扩大培养及菌种保存 |
| 4.2.4 根癌农杆菌介导的毛果杨遗传转化 |
| 4.2.5 转基因毛果杨的分子鉴定 |
| 4.3 PtrIDP1转基因毛果杨在盐胁迫下的抗逆性分析 |
| 4.3.1 转基因毛果杨在盐胁迫下的形态学分析 |
| 4.3.2 转基因毛果杨耐盐生理指标分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 重组质粒农杆菌转化 |
| 4.4.2 转PtrIDP1基因毛果杨植株的获得 |
| 4.4.3 转PtrIDP1基因毛果杨PCR鉴定 |
| 4.4.4 转基因毛果杨在盐胁迫下的形态学分析 |
| 4.4.5 转基因毛果杨在NaCl胁迫下的生理指标分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、林木转基因工作研究进展（论文参考文献）
- [1]白桦BpERF1.1基因在低温、干旱和盐胁迫中的功能研究[D]. 林昕. 东北林业大学, 2021
- [2]白桦BpSPL基因家族鉴定及BpSPL2基因在不定根发生中的功能研究[D]. 胡晓晴. 东北林业大学, 2021(09)
- [3]小黑杨单倍体愈伤悬浮培养体系建立及遗传转化PsnCYCD1;1研究[D]. 刘炎. 东北林业大学, 2021(08)
- [4]PtrCAld5H2和PtrCOMT2基因在84K杨中的共同遗传转化研究[D]. 刘慧新. 东北林业大学, 2021(08)
- [5]小黑杨单倍体悬浮细胞筛选体系的建立及应用研究[D]. 刘彩霞. 东北林业大学, 2021
- [6]大青杨PuHox52响应低氮胁迫的分子机制[D]. 魏明. 东北林业大学, 2021(09)
- [7]大青杨PuMYB40调控低磷诱导不定根发生的分子机制[D]. 王瀚增. 东北林业大学, 2021(09)
- [8]水曲柳DELLA家族基因应答低温胁迫及参与被动休眠调控研究[D]. 于磊. 东北林业大学, 2021
- [9]锌指蛋白PuC3H35调控大青杨根部应答干旱胁迫的机制研究[D]. 李丹丹. 东北林业大学, 2020(09)
- [10]毛果杨PtrIDP1基因的克隆及功能分析[D]. 董实伟. 东北林业大学, 2020(08)