一、利用多聚赖氨酸和鲎试剂检测细菌内毒素（论文文献综述）
李云飞[1]（2021）在《组胺对SARA奶牛中性粒细胞粘附的影响及机制》文中研究说明系统性炎性反应是亚急性瘤胃酸中毒（SARA）及其引发的炎症性疾病和生产性能受损之间的纽带,是奶牛SARA本身及造成其它危害的关键环节。中性粒细胞（PMN）具有强大的调控炎性放大功能,SARA奶牛血液高脂多糖（LPS）和组胺可能通过调控PMN粘附介导系统性炎性反应的发生,然而其调控机制尚不清楚。据此,本论文通过对比SARA（N=15）与健康奶牛（N=15）的外周血代谢和免疫指标,发现SARA奶牛外周血血清中LPS和组胺的含量显着升高;血清中炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）以及急性期反应蛋白脂多糖结合蛋白（LBP）、触珠蛋白（Hp）和血清淀粉样蛋白A（SAA）的水平均有不同程度的升高,表明SARA奶牛存在系统性炎性反应,并可能与血液高浓度LPS和组胺有关。据此进行了以下实验,在体内实验中,分离健康（N=15）与SARA奶牛（N=15）的外周血PMN后,通过离体粘附实验、免疫印迹实验检测了PMN的粘附能力和相关蛋白表达,结果显示SARA奶牛PMN粘附能力增强,主要膜蛋白粘附分子CD11a和CD11b表达增多。体外实验中,分离健康奶牛PMN后,给于病理浓度的LPS（4EU/m L）或组胺（7μmo L/L）处理4h后发现,病理浓度的组胺（而非LPS）引起了PMN的粘附以及主要粘附分子在细胞膜上水平的升高,但主要粘附分子的m RNA水平并没有显着性变化,据此明确了SARA奶牛血液高组胺会促进PMN的粘附以及粘附分子的累积,提示PMN粘附分子水平的增高可能是由于其降解的受阻。自噬在调控粘附分子循环稳态中起着重要作用。体内实验发现,透射电镜下SARA奶牛PMN与健康奶牛相比,PMN内自噬降解受阻,存在较多自噬体小泡,免疫印迹结果显示SARA奶牛PMN主要自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3-II（LC3-II）以及自噬降解底物蛋白P62的累积,此外LC3-II和P62在SARA奶牛PMN中并没有表现出m RNA水平的差异性,表明SARA奶牛PMN自噬过程受损;体外实验中通过免疫印迹实验发现病理浓度的组胺显着增加PMN自噬相关蛋白LC3-II和P62以及主要粘附分子的蛋白水平,通过免疫荧光实验发现,病理浓度的组胺显着增加了LC3-II以及主要粘附分子CD11b在胞内或胞膜上的累积,其作用与自噬抑制剂氯奎对PMN的作用相同,表明体外高浓度组胺可以通过损害自噬介导PMN粘附增强。以上结果证实,SARA奶牛外周血组胺升高,高浓度的组胺会通过引起PMN自噬的阻断介导PMN粘附增强,为SARA奶牛系统性炎性反应的诱因和机制的阐明提供理论基础。
罗暄巾[2]（2021）在《贵州疣螈（Tylototriton kweichowensis）cathelicidin家族宿主防御肽的抗炎和伤口愈合功能及作用机理研究》文中研究说明Cathelicidin是脊椎动物所特有的一个宿主防御肽家族,具有多种生物学功能,如抗菌、免疫调节、伤口愈合等。贵州疣螈（Tylototriton kweichowensis）隶属两栖纲蝾螈科疣螈属动物,目前仅分布在贵州西部、云南,为中国特有种,是国家二级保护动物。在民族医药中常将其去内脏干制入药,治疗皮肤痒疹,烧伤、烫伤等。目前尚无贵州疣螈cathelicidin家族宿主防御肽的相关报道。本课题以贵州疣螈为研究对象,对其皮肤来源的cathelicidin家族宿主防御肽进行系统研究。本论文从贵州疣螈皮肤中提取总RNA,利用CreatorTM SMARTTMc DNA Library试剂盒构建其c DNA文库,根据两栖类cathelicidin分子前体序列保守区设计引物,利用PCR扩增得到编码贵州疣螈cathelicidin分子的c DNA序列。经分析比对,确定成熟肽序列并合成多肽,对合成的多肽进行生物学功能测定。使用二倍稀释法检测多肽的抗菌活性;ELISA检测多肽对LPS诱导小鼠巨噬细胞（RAW264.7）中促炎因子TNF-α和IL-6分泌的抑制作用;内毒素试剂盒检测多肽中和LPS的活性;Western blot法检测多肽对LPS激活的MAPKs炎症信号通路蛋白表达的影响。MTT法和细胞刮痕法检测多肽对角质细胞（Ha CAT）的增殖及迁移的影响;小鼠全层皮肤伤口模型检测多肽促进伤口愈合的活性;ELISA检测多肽诱导的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）上清液中TNF-α、CXCL1、MCP-1、TGF-β的分泌水平;Western blot法检测多肽对MAPKs信号通路蛋白表达水平的影响。此外,还对其抗氧化活性、细胞毒性和溶血活性进行研究。通过基因克隆的方法,我们从贵州疣螈皮肤中成功获得了一条新的cathelicidin家族宿主防御肽编码基因,该基因编码一种新型cathelicidin家族宿主防御肽,命名为TK-CATH（GGQDTGKEG ETGKKKKSDNWFMNLLNKFLELIGLKEAGDDSEPFCFTCIFDMFS Q）,共55个氨基酸残基,多肽带有3个负电荷,其分子量为6196.99Da。抗菌实验结果表明,TK-CATH不具有直接抗菌活性,在浓度高达200μg/ml时,其对10株受试菌株均没有抗菌活性。相反,它表现出强大的抗炎和伤口愈合作用。TK-CATH通过抑制脂多糖（LPS）激活的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路,有效地减少了LPS诱导的小鼠巨噬细胞中促炎因子TNF-α和IL-6的产生,其与脂多糖较弱的中和能力暗示其具有特殊的抗炎靶点和抗炎机制。此外,TK-CATH能直接激活MAPKs信号通路,上调ERK、JNK、p38的磷酸化水平,有效诱导小鼠巨噬细胞（RAW264.7）产生细胞因子TNF-α、趋化因子（CXCL1、MCP-1）和生长因子TGF-β。TK-CATH能促进角质细胞（Ha CAT）的增殖和迁移,在小鼠全层伤口模型中表现出良好的促进伤口愈合活性。这说明TK-CATH参与了伤口愈合过程的炎症期和新生组织形成期。此外,TK-CATH具有较弱但有效的自由基清除活性、较低的细胞毒性和溶血活性。本研究从贵州疣螈的皮肤中鉴定出一种新型阴离子cathelicidin宿主防御肽（TK-CATH）。TK-CATH对受试微生物没有直接抗菌活性。相反,它表现出强大的抗炎和伤口愈合作用。此外,TK-CATH还具有较弱但有效的自由基清除活性,较低的细胞毒性和溶血活性。以上结果表明,TK-CATH是一种存在于贵州疣螈体内的多功能分子,它可能在贵州疣螈抵抗细菌感染和皮肤伤口愈合的免疫应答中发挥重要作用。
朱迎男[3]（2020）在《两性离子水凝胶伤口敷料的研究与开发》文中进行了进一步梳理皮肤创伤是最常见的身体损伤之一,对于伤口处理方法和伤口敷料的研究一直备受关注。传统的纱布、绷带等伤口敷料可以保护伤口,吸收渗液,但是这类干性敷料存在诸多缺陷不利于伤口愈合。随着伤口愈合理论研究的深入和生物医用材料的发展,人们发现湿润环境更有利于伤口愈合。基于湿性愈合理论和亲水抗生物粘附的两性离子材料,本文设计并开发了多种两性离子水凝胶伤口敷料,并研究这些敷料对急性和慢性伤口愈合过程的影响,以获得防止伤口粘连、促进伤口愈合、防治伤口感染的理想敷料。本文首先研究了两性离子水凝胶伤口敷料对小鼠烫伤伤口的影响。通过制备两性离子羧酸甜菜碱（PCB）水凝胶敷料,发现和商业敷料Duoderm?相比,PCB水凝胶敷料含水量高,能够持久为伤口部位提供湿性愈合环境,促进细胞迁移和增殖,使伤口的愈合速度提高1/3。此外,将PCB水凝胶与传统的纱布、创可贴相结合,制备了便携的新型水凝胶纱布,水凝胶创可贴,能够有效防止伤口粘连。细菌入侵是造成伤口感染,阻碍愈合的重要因素。两性离子水凝胶具有抗细菌附着和定殖的性质,但不足以杀灭病菌治疗伤口感染。我们采用“一步法”,在两性离子水凝胶形成的同时原位还原生成纳米银（Ag NPs）,发现当Ag NO3的浓度为10 m M时,制备的PCB-Ag NPs水凝胶敷料能有效杀灭E.coli和S.aureus。将该PCB-Ag NPs水凝胶敷料用于小鼠感染伤口的治疗,证明该敷料能有效缩小伤口感染面积,在两周时间内实现完全愈合。本文还合成了具有双重抗菌效应的卟啉镓抗菌剂（Ga PP、Ga MP）,并利用合成的新型抗菌剂制备了具有缓释作用的PCB水凝胶。其能够同时发挥卟啉类光敏剂的光动力抗菌作用和镓离子阻断细菌铁代谢的抗菌作用,协同抗菌,相比暗反应抗菌效率显着提高。针对糖尿病慢性伤口愈合缓慢且困难的问题,本文开发了一种可实时监测糖尿病伤口p H值和葡萄糖浓度的多功能水凝胶敷料。在复杂生物溶液环境中有效保持葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HPR）的酶活,使其Kcat/Km分别提高1.7倍和5.5倍。该多功能伤口敷料能实现p H 4-8和葡萄糖0.1-10 m M浓度范围内的精准检测,满足人体伤口环境的检测需求。通过手机采集和分析图像数据,精准定量分析伤口p H值和葡萄糖浓度,为糖尿病伤口提供非侵入式实时监测并且有利于促进伤口愈合。
李慧珍[4]（2020）在《猪内脂素重组蛋白的优化及其在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用》文中研究指明内脂素（Visfatin）是一种新型脂肪细胞因子,与机体炎症和免疫应答反应密切相关。断奶仔猪免疫应激是影响仔猪生产性能的重要原因之一,其主要的病理变化是炎症反应,但最终导致仔猪生长的受阻,给畜牧业生产造成巨大经济损失。本实验室前期研究表明,在脂多糖（LPS）诱导的断奶仔猪免疫应激动物模型中,脾脏白髓和红髓中的内脂素阳性表达产物显着增多,推测内脂素作为炎性介质可能参与了断奶仔猪免疫应激炎症反应的发生和发展。为了获得大量内毒素含量低、并具有生物活性的猪内脂素重组蛋白,并明确其在断奶仔猪免疫应激反应中的作用。本研究首先利用原核表达,蛋白质纯化,生物活性验证,Western Blot,q RT-PCR和ELISA技术制备猪内脂素重组蛋白。然后在利用LPS诱导成功构建的断奶仔猪免疫应激模型基础上,通过q RT-PCR,ELISA,免疫组织和TUNNEL法研究内脂素在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用。具体研究结果如下:1猪内脂素重组蛋白的原核表达及纯化条件优化以猪肝脏组织总RNA为模板,利用PCR技术,扩增猪内脂素基因,转入p EASY-T1载体后,再转化Trans5α。进行质粒提取,并与p ET-28a和p ET-30a同时进行Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切;将胶回收得到的Visfatin目的基因片段分别连接到p ET-28a和p ET-30a载体上,转化DH5α,对含有目的基因的表达载体进行克隆;提取重组表达质粒分别转入大肠杆菌Trans BL21和Transetta,经IPTG诱导表达、蛋白经纯化系统AKTAprime10纯化后,采用SDS-PAGE和Western Blot技术进行检测。结果表明,Visfatin-p ET28a-Transetta在16℃诱导16h条件下,能稳定表达出大量高纯度的猪重组内脂素蛋白,为最优表达菌株。2猪内脂素重组蛋白中内毒素去除及检测各国对生物制品的内毒素含量都有严格的要求,为保证生物制品使用的安全性,必须加以去除。本试验选用内毒素去除试剂进行猪内脂素重组蛋白中内毒素的去除,并使用内毒素检测鲎试剂盒检测去除效果。结果表明,去除内毒素后的猪内脂素重组蛋白残余量低于1EU/m L,在安全范围内,防止了其可能对后续试验结果判断产生的影响。3猪内脂素重组蛋白生物活性验证将去除内毒素后的猪内脂素重组蛋白作用于Raw264.7细胞。CCK-8结果显示,随着内脂素浓度的增加,细胞存活率先升高后降低,均高于阴性对照组,当浓度为700 ng/m L时,细胞存活率最高,且差异极显着（p?0.0001）,提示内脂素具有促进Raw264.7细胞存活的作用。随后分别设置PBS组、Visfatin组和Visfatin+Poly.B组,并与细胞共孵育6h。q RT-PCR和ELISA结果显示,与PBS组相比,Visfatin组炎症因子IL-1β、TNF-α和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均差异极显着上调;而Visfatin+Poly.B组与Visfatin组相比,炎症因子的m RNA和蛋白表达水平却均没有明显差异。上述结果表明,猪内脂素重组蛋白促进Raw264.7细胞的炎症活动,而残留的内毒素不起作用,证明猪内脂素重组蛋白具有生物学活性。4猪内脂素重组蛋白对断奶仔猪炎症因子表达的影响利用LPS诱导构建断奶仔猪免疫应激模型,测定每头猪的体重及脾脏重量,并计算脾脏指数（脾脏重量（g）/体重（kg））,结果显示:与PBS组相比,LPS组脾脏重量和脾脏指数明显上升,且均差异极显着（p?0.001）,Visfatin组的则无显着变化;而LPS+Visfatin组脾脏重量和脾脏指数与LPS组的相比,明显降低,且均差异极显着（p?0.01）。采用q RT-PCR和ELISA技术检测各组脾脏组织中炎症因子IL-1β、IL-6和MCP-1表达变化,结果显示,与PBS组相比,Visfatin组IL-1β、IL-6和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均没有明显差异,而LPS组的却均显着升高。与LPS组相比,LPS+Visfatin组IL-1β、IL-6和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均显着降低。以上结果表明:LPS激活脾脏免疫系统,诱使淋巴细胞合成大量的炎性细胞因子,致使脾脏功能亢进肿大,而内脂素能通过下调炎症因子的表达,降低LPS引起的脾脏组织炎性损伤。5猪内脂素重组蛋白对断奶仔猪抗氧化功能的影响采用ELISA检测各组猪外周血清中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、溶菌酶（LZM）和超氧化物歧化酶（SOD）的表达量变化。结果显示:与PBS组相比,Visfatin组的MDA表达量无显着差异,GSH-Px和SOD均明显升高,而LPS组的MDA的表达量却明显升高,且差异极显着（p?0.01）,但GSH-Px无明显变化,而SOD和LZM均明显升高。LPS+Visfatin组与LPS组相比,MDA的表达量明显降低,且差异显着（p?0.05）,GSH-Px、SOD和LZM均显着升高。结果表明,内脂素通过提升机体的抗氧化功能,降低断奶应激对仔猪造成的氧化损伤;LPS刺激后,机体发生了严重的氧化损伤,外源性注射内脂素降低了血清中MDA的含量,提高SOD、GSH-Px和LZM的酶活性,证明内脂素通过提升断奶仔猪的抗氧化功能降低免疫应激对机体造成的损伤。6猪内脂素重组蛋白对断奶仔猪外周免疫器官细胞增殖和凋亡的影响采用免疫组化、TUNEL技术以及Leica Image Scope软件,研究并统计分析了不同组脾脏和肠系膜淋巴结组织内细胞的增殖和凋亡。免疫组化法检测增殖细胞核抗原（PCNA）结果显示:增殖细胞阳性信号PCNA主要分布于脾脏和肠系膜淋巴结组织内的生发中心;与PBS组相比,Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内PCNA阳性率均显着升高,而LPS组的却均差异极显着降低;与LPS组相比,LPS+Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内PCNA阳性率均明显升高,且差异均极显着（p<0.01）。TUNEL检测结果显示:与PBS组相比,Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内凋亡细胞阳性率均有降低的趋势;与LPS组相比,LPS+Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内凋亡细胞阳性率均差异均极显着降低。此外,利用q RT-PCR技术检测脾脏组织内细胞凋亡的相关基因,结果显示:与PBS组相比,LPS组的FAS和caspase-3表达均明显上调,且差异极显着（p<0.0001）,Visfatin组caspase-3呈下降趋势。而与LPS组相比,LPS+Visfatin组FAS和caspase-3表达则均差异极显着降低。上述结果表明,内脂素通过促进外周免疫器官脾脏和肠系膜淋巴结组织细胞增殖、抑制的细胞凋亡,改善断奶应激仔猪的免疫机能;LPS激活了线粒体凋亡途径,从而抑制了细胞增殖,促使脾脏和肠系膜淋巴结发生凋亡损伤。而外源性注射内脂素通过抑制LPS刺激诱导的外周免疫器官细胞凋亡、促进外周免疫器官细胞增殖、降低FAS和caspase-3的表达,改善机体发生免疫应激时的免疫状况。
龙似维[5]（2020）在《多粘菌素B对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的影响及机制的研究》文中认为目的通过建立大鼠局灶性脑缺血-再灌注（ischemical reperfusion,I/R）模型,从神经行为学评分、脑梗死组织含水量、组织炎症细胞浸润、白细胞介素（Interleukin,IL）-1β、肠道通透性及外周血脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）的角度分析多粘菌素B对该模型的影响,探讨其机制。方法依据随机原则,将120只健康的10周龄雄性清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠共分为3组:假手术组（sham-operated group）、大脑中动脉（右侧）缺血-再灌注模型组（middle cerebral artery occlusion/reperfusion model group）,多粘菌素B处理组（Polymyxin B group）,每组各40只。采用改良的Longa线栓法[1],制备大鼠右侧MCAO/R模型。采用Longa神经功能缺损评分表,评分>1分,认为造模成功。造模成功后立即进行以下操作:PMB组使用1m L注射器经腹腔注射PMB溶液（2.5μg/g）[2],sham组和MCAO/R组均同法给予相当体积的生理盐水。在脑I/R造模24h时,三组大鼠使用Bederson神经功能缺损评分表进行神经行为学评分,使用干湿比重法计算右侧大脑半球脑组织含水量,使用苏木精-伊红染色法（H-E染色）观察大鼠右侧海马CA1区组织病理学表现,使用反转录聚合酶链式反应技术测量大鼠右侧海马CA1区IL-1βm RNA的表达,使用荧光分光光度法测量外周血异硫氰酸荧光素-右旋糖酐（Fitc-Dextran-4k D,FD4）浓度,使用鲎试剂终点显色法测量外周血LPS浓度。以均数±标准差（±s）记录数据,对数据进行正态性和方差齐性分析。组间比较采用方差分析,组内比较采用t检验。所有数据采用SPSS 21.0进行统计分析。认为P<0.05具有统计学差异。结果1、Bederson评分评估大鼠神经功能缺损情况:sham组无神经功能障碍;与sham组相比,MCAO/R组神经功能缺损评分显着升高（P<0.01）;与MCAO/R组相比较,PMB组神经功能缺损评分有显着下降（P<0.01）。2、干湿比重法测量脑组织的含水量:与sham组相比,MCAO/R组脑组织含水量升高明显（P<0.01）;与MCAO/R组相比,PMB组脑组织含水量显着降低（P<0.01）。3、H-E染色法观察右侧脑组织海马CA1区脑组织的组织学变化:sham组该区组织细胞形态正常;MCAO/R组该区神经细胞浓缩,排列紊乱,细胞间隙增宽,细胞间质疏松、肿胀;与MCAO/R组相比,PMB组该区神经细胞浓缩和间质肿胀情况均有明显好转,细胞排列相对规整。4、RT-PCR技术测量右侧脑组织海马CA1区IL-1βm RNA的表达:sham组的IL-1βm RNA呈低水平表达;与sham组相比,MCAO/R组IL-1βm RNA的表达水平显着升高（P<0.01）;与MCAO/R组相比,PMB组IL-1βm RNA的表达水平明显下降（P<0.01）,但仍较Sham组升高（P<0.01）。5、荧光分光光度法测量大鼠外周血FD4浓度:与sham组相比,MCAO/R组外周血中FD4的浓度明显升高（P<0.01）;与MCAO/R组相比,PMB组外周血中FD4的浓度显着下降（P<0.01）。6、鲎试剂终点显色法测量大鼠外周血LPS浓度:与Sham组相比,其他2组LPS浓度均不同程度升高（P<0.01）;与MCAO/R组相比,PMB组外周血LPS浓度明显减低（P<0.01）。结论1、PMB可以减轻大鼠局灶性脑I/R损伤模型的神经功能缺损评分及脑组织水肿。2、PMB可以改善大鼠局灶性脑I/R损伤模型肠道通透性、降低外周血中LPS浓度,从而减轻缺血区域海马CA1区的细胞损伤、下调海马CA1区的IL-1βm RNA的表达。3、PMB通过降低外周血LPS浓度,减轻脑I/R后海马CA1区损伤,从而减轻脑水肿,减低神经功能评分。
曹才文[6]（2019）在《乌司他丁预防重症中暑小鼠早期肠粘膜屏障功能损害的实验研究》文中研究说明研究背景和目的随着全球气候变暖以及热浪袭击频率和强度的逐年增加,中暑（Heatstroke,HS）的发病率明显增加。中暑如未得到正确救治,可能导致严重的多脏器损害,病死率高达10%～50%。目前对于中暑研究的普遍观点认为,中暑的病理生理学反应不仅仅是由热暴露的直接损伤引起的,而更多的是一种继发于热损伤之后的全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome,SIRS）,进而引发多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome,MODS）的过程。既往研究表明肠道作为体内最大的“储菌库”和“内毒素库”,以其在体内独特的生理环境参与SIRS和MODS的病理生理过程,因此肠道被称之为“MODS的原动力”。肠屏障功能可因各种因素而改变,各种刺激因素致肠粘膜屏障功能损伤后,使肠内细菌移位,内毒素、细菌、抗体介质不断进入血液和淋巴液,导致多种炎症介质释放,引发和加重失控性炎症反应综合征,而SIRS的发生更加重了肠道损伤,形成恶性循环,最终导致MODS。在对重症中暑的研究中已发现存在胃肠病变,包括肠道粘膜受损,肠上皮细胞凋亡、肠通透性增加等。Lambert等观察大鼠肠道（包括十二指肠、空肠、回肠和结肠）对高热打击的反应中,发现当大鼠核心体温达到42.5℃C后可见肠上皮细胞破坏,微绒毛丧失,紧密连接开放,线粒体肿胀、空泡化,并且对异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖的通透性增加。临床死亡的中暑病例主要症状常常包括胃肠道出血、内毒素血症,提示中暑肠屏障功能损害和全身炎症反应密切相关。后来一系列的实验室研究也发现,热打击与肠道衍生脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）有关,而去除LPS或治疗内毒素血症后,则对中暑预后有利,这些结果提示了内毒素血症中炎性细胞因子反过来加重肠粘膜损害,二者形成互为作用、互为因果。因此,要预防中暑肠源性内毒素血症和细菌移位发生,除“快速降温”外,针对于改善肠粘膜屏障功能的“第二关键点”治疗策略同样具有重要意义。乌司他丁（Ulinastatin,UTI）是从男性尿液分离纯化出来的尿胰蛋白酶抑制剂,能同时抑制磷脂酶A2,胰蛋白酶,弹性蛋白酶等多种水解酶活性;此外,还有改善休克时的循环状态,抑制心肌抑制因子的产生,抑制炎症介质的释放,稳定溶酶体膜等功能,目前广泛应用于临床。目前研究已证实UTI对多种疾病造成的肠粘膜损伤具有保护作用,然而对于UTI是否也对重症中暑肠粘膜损害具有保护作用,目前较少报道。鉴于以上现状,本研究通过建立热打击中暑小鼠动物模型,探讨高热对肠粘膜屏障功能的影响及其与全身炎症反应的相关性;进一步使用UTI预处理中暑动物,观察UTI对重症中暑动物模型肠粘膜屏障的影响。方法:采用6-8周龄SPF级雄性BALB/c小鼠(SYXK（YUE）2011-0015]建立中暑模型,随机分为对照组、40℃热打击组、42℃热打击组;观察药物治疗效应随机分为sham组、HS组（42℃热打击）、低剂量UTI组（5000U/kg）及高剂量UTI组（10000U/kg）。对照组/sham组动物始终置于常温下（25±0.5℃）,热打击组置于仿真气候舱内,舱内温度（35.5±0.5）℃,湿度（60±5）%,每30min用肛温表测小鼠直肠温度,当小鼠体温达到41.5 ℃时,每10min测小鼠直肠温度,40℃热打击组小鼠在体温达到40℃时停止热打击,42℃C热打击组小鼠体温达到42℃即停止热打击,各组动物按照不同复温时间点分为0、1、3、6、12、24h。药物治疗组在造模前腹腔注射UTI 5000U/kg或10000U/kg,24h/次,连续3d;sham组和HS组给予腹腔注射等量（容积）生理盐水,24h/次,连续3d。观察药物治疗效应所有动物均在成模后复温12h处死动物。组织病理和电镜观察各组小鼠肠粘膜组织形态学的改变;细菌学方法观察肠道细菌向肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph nodes,MLN）、肝、脾、肾等移位的频率及组织细菌含量;鲎试剂比色法检测血清内毒素;酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA法）检测腔静脉血浆LPS、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）及肿瘤坏死因子-a（Tumornecrosis factor-a,TNF-a）的含量;免疫组化观察TJ蛋白（紧密连接蛋白）Occludin和ZO-1表达;TUNEL法检测肠粘膜上皮细胞凋亡率。统计学处理 所有数据录入SPSS17.0统计软件进行统计学分析,计量资料采用x±s表示,两组资料的均数比较采用t检验。多组间均数比较采用单因素方差分析,若方差齐采用LSD法进行组间比较,方差不齐则采用Games-Howell方法进行组间比较,P<0.05认为有统计学意义。结果 本课题研究主要结果如下1、通过建立的小鼠中暑动物模型,采用鲎试剂比色和酶联免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）的技术方法,研究肠粘膜屏障功能的变化对中暑后早期全身炎症反应的影响。使用Kaplan-Mier曲线和Log Rank检验评估中暑小鼠生存时间和生存率的改变。结果发现:1.1热打击过程中核心体温变化呈“双峰”样改变,在小鼠遭受热打击前15min先迅速升高到达39℃左右,15min～30min又迅速降至近38℃,之后随着热打击时间而逐渐上升,在体温达到41℃之前有一段较长的稳步上升期,其后当体温达到41℃后上升幅度加大,迅速上升至42℃以上。当小鼠体温到达42℃时生命体征极不稳定,可在短短10～30min体温急剧上升到43℃以上并死亡。本研究选取小鼠核心体温达到40℃及42℃后行复温观察,结果发现不同程度热打击后进行复温的体温可短时间（30min）迅速下降,并且热打击程度越重复温时体温降的越低。1.2小鼠全身炎症反应观察 小鼠腔静脉血浆LPS、TNF-a和IL-6水平与热打击程度及复温时间相关。使用重复测量方差分析方法,得到温度与血浆LPS存在交互效应（F=12.685,P<0.001）,与对照组比较,40℃组小鼠在复温1h开始血浆LPS开始升高,复温3h显着上升,至24达高峰;42℃组小鼠血浆LPS浓度在热打击后Oh即明显上升,其上升幅度明显大于40℃组。与对照组和40℃组小鼠比较,42℃组小鼠血浆TNF-a和IL-6水平显着上升,并且呈复温依赖性升高,差异有显着统计学意义。与对照组比较,40℃组小鼠血浆TNF-a和IL-6水平也有明显升高,差异有统计学意义（P<0.001）。1.3小鼠生存时间分析 本研究中常温对照组和40℃热打击组小鼠全部存活超过72h,而42℃组小鼠复温后72h内全部死亡,死亡率100%,其中大部分在24h内死亡,其中位生存时间为18h。2.采用组织病理形态学分析、电镜超微结构观察、细菌学分析、酶联免疫吸附（ELISA）、TUNEL及免疫组化等技术方法,探讨肠粘膜屏障功能障碍与全身炎症反应及肠上皮细胞凋亡的相关性。2.1 HE染色观察肠粘膜损伤 40℃热打击组小鼠回肠粘膜厚度均匀,肠上皮较为完整,绒毛排列尚规则,固有层略疏松,有少量淋巴细胞浸润,有炎性细胞浸润。42℃热打击组小鼠肠粘膜明显萎缩,黏膜层和固有层重度分离,绒毛基本完全脱落,固有层裸露、水肿,淋巴细胞及中性粒细胞浸润。与对照组比较,热打击组在小肠绒毛高度（F=84.833,P=0.000）、厚度（F=116.006,P=0.000）及表面积（F=63.27,P=0.000）,差异有显着统计学意义。2.2电镜观察肠粘膜损伤 40℃热打击后小鼠肠黏膜上皮细胞表面微绒毛排列尚整齐,部分上皮细胞轻度肿胀,线粒体肿胀、灶性空化,粗面内质网轻度扩张;42℃热打击后上皮细胞微绒毛稀疏、排列不整、呈倒伏状、部分缺如,上皮细胞连接增宽、形成大量指状突起,部分紧密连接增宽或开放,部分上皮细胞胞质可见空泡样结构,线粒体肿胀,内质网扩张。与对照组比较,热打击组小鼠肠粘膜超微结构改变明显。2.3小鼠热打击后各脏器细菌检出情况40℃热打击组样本和对照组无显着差异,42℃热打击组小鼠细菌检出了显着高于对照组和40℃热打击组（χ2=100,p=0.000）。2.4中暑小鼠早期出现肠粘膜屏障功能损害 对照组比较,血浆中DAO活性在40℃热打击轻度升高,42℃热打击后显着升高,与对照组和40℃热打击组比较有显着统计学意义（F=33.928,P=0.000）。热打击后血浆D-乳酸浓度变化与血浆DAO活性变化有所不同,40℃热打击与对照组比较无明显升高,42℃热打击后显着升高,与对照组和40℃热打击组比较有显着统计学意义（F=49.745,P=0.000）。2.5肠屏障功能障碍与全身炎症反应的相关性分析 对代表肠粘膜屏障功能损害的指标二胺氧化酶（Diamine oxidase,DAO）活性和D-乳酸浓度与反映全身炎症反应的指标（血浆INF-a、IL-6和LPS）的相互关系进行线性回归及直线相关分析,结果显示:小鼠血浆炎症反应的指标（血浆INF-a、IL-6和LPS）与血浆DAO活性（P值均小于0.001,相关系数分别为r=0.8075、0.8358、0.8341）和D-乳酸浓度（P值均小于0.001,相关系数分别为r=0.8111、0.8001、0.8107）呈显着正相关,说明肠屏障功能损害在中暑全身炎症反应中的发生中起着非常重要的作用。2.6免疫组化检测肠道TJ蛋白Occludin和ZO-1表达常温对照组的TJ蛋白Occludin和ZO-1均匀一致的分布于小肠粘膜上皮细胞连接处的尖端,呈蜂巢状;40℃热打击组的Occludin和ZO-1表达分布较一致,但与对照组比较表达减少;40℃热打击组Occludin和ZO-1表达显着减少,染色浅见图2-6和2-7。通过计算免疫组化平均OD值发现:热打击组Occludin和ZO-1蛋白的0D值明显低于对照组,各组之间比较有显着统计学意义（p<0.05）,这一结果提示中暑后肠道精密连接受损,即中暑可能早期诱导细胞旁途径的肠粘膜屏障损伤。2.7肠道TJ蛋白与小肠屏障功能损害和全身炎症反应的相关性分析 线性回归及直线相关分析显示:紧密连接蛋白Occludin和ZO-1与小鼠血浆炎症反应的指标（血浆TNF-a、IL-6）（P<0.001,相关系数分别为r=0.8156、0.8858、0.8548、0.9290）,呈显着正相关。这一结果提示中暑小鼠全身炎症反应和肠粘膜屏障损害有关。Occludin和ZO-1与血浆DAO活性（P<0.001,相关系数分别为r=-0.7640、-0.8003）和D-乳酸浓度（P<0.001,相关系数分别为r=-0.7215、-0.7639）呈显着负相关。这一结果提示DAO活性及D-乳酸浓度能较好反映中暑小鼠肠粘膜屏障功能。2.8 TUNEL法肠粘膜细胞原位凋亡检测 42℃C热打击组绒毛顶端及隐窝部可见较多的凋亡细胞。对照组、40℃C热打击组和42℃C热打击组的凋亡指数（AI）分别为3.95±0.96,9.55±2.20和33.72±6.14,与对照组比较,40℃C热打击组和42℃热打击组第细胞凋亡指数均具有显着统计学意义（χ2=47,P=0.000）。2.9肠粘膜上皮细胞凋亡指数（Apoptotic index AI）与小肠屏障功能损害和全身炎症反应的相关性分析 将不同程度热打击后小鼠肠上皮细胞AI分别与血浆DAO活性、D-乳酸浓度以及血浆INF-a、IL-6水平进行线性回归及直线相关分析,结果显示:1、AI 与血浆DAO活性（r=0.8687,p=0.000）和D-乳酸浓度（r=0.8388,p=0.000）,呈高度正相关。2、AI与血浆INF-a（r=0.9001,p=0.000）和IL-6（r=0.9193,p=0.000）水平呈显着正相关。3、采用前述技术方法,观察UTI预处理对重症中暑早期肠粘膜屏障的保护作用并对重症小鼠行生存分析。结果发现,与HS组（单纯热打击组）相比,UTI预处理组小鼠肠粘膜组织形态学、肠粘膜组织超微结果及肠屏障功能有明显改善;细菌移位率、血浆LPS浓度及炎症因子IL-6、TNF-a明显降低,重症中暑小鼠全身炎症反应明显减轻;肠道TJ蛋白Occludin和ZO-1表达增加;肠上皮细胞凋亡指数明显下降;同时生存分析显示UTI预处理也显着改善重症中暑小鼠的生存时间和生存率。并且,上述损伤指标在大剂量UTI（10000U/kg）组改善更为显着。结论:本课题在成功复制课题组前期中暑动物模型基础上,从整体动物水平阐述了中暑后早期肠粘膜屏障功能损害的发生机制及其与全身炎症反应的关系,并初步探讨了不同剂量UTI预处理对重症中暑后早期肠粘膜屏障功能损害的保护作用及机制。通过研究我们发现（1）中暑动物体温变化和生存时间与小鼠核心体温有关,中暑后小鼠全身炎症反应明显。（2）中暑后肠粘膜屏障功能损害可能是SIRS,甚至MODS的主要病理机制,其中肠上皮细胞大量凋亡可能是肠粘膜屏障功能受损的重要因素。（3）乌司他丁能有效减轻重症中暑早期肠上皮细胞凋亡、从而改善肠粘膜损害,减轻全身炎症反应水平,改善中暑动物预后。
张涛[7]（2019）在《从肠粘膜免疫稳态重建探讨“温阳解毒化瘀方”治疗ACLF的干预机制》文中提出目的:从肝脏、小肠粘膜组织病理学,肠道菌群、肠粘膜免疫屏障功能变化探讨“温阳解毒化瘀方”对ACLF大鼠肠粘膜免疫稳态重建的影响。方法:D-氨基半乳糖+脂多糖联合肝纤维化大鼠诱导建立ACLF大鼠模型;将其分为:模型对照（M）组、中药低剂量（Z低）组、中药高剂量（Z高）组、肠道菌群活性菌治疗（C）组,每组各10只,另设非模型空白对照（N）组;对比以不同剂量”温阳解毒化瘀方”进行为期4周的干预治疗;收集新鲜粪便进行16S rRNA高通量焦磷测序检测;采集外周血行TBil、ALT、AST检测,血清鲎试剂检测内毒素;ELISA法测定血清中TNF-α、IL-6、IL-1含量;HE染色判定肝脏组织及小肠粘膜组织病理学,透射电镜观察小肠粘膜超微病理学,荧光定量PCR及Western-Blot技术观察肝组织中TLR4的表达及小肠粘膜组织中occludin和ZO-1的表达。结果:1.肝组织HE染色示Z高组肝细胞坏死面积较其他实验组减小,病变程度明显减轻,2.小肠粘膜组织HE染色示Z高组在改善绒毛上皮细胞脱落、黏膜层和黏膜下层水肿以及炎性细胞增生明显优于其他实验组。3.采用16S rRNA高通量焦磷酸测序技术,结果显示:M组肠道菌群的Shannon指数、Observed OTU指数、Faith’s指数及chao1指数显着低于Z高组与C组（P<0.05）;经Alpha、Beta分析,Z高组与M组、Z低组间存在显着的差异（P<0.01）,C组与M组、Z低组大鼠间存在显着差异（P<0.05）,C组与Z高组间无统计学差异（P>0.05）。4.各实验组大鼠外周血ALT、AST、TBil值比较:Z高组降低ALT、AST效果最佳;Z高、Z低降低TBil疗效相当（P>0.05）;5.血清TNF-α、IL-6、IL-1值比较:各实验组均较M组显着下降（P<0.05）,Z高组降低IL-6、IL-1疗效更显着（P<0.05）;Z高组与C组降低TNF-α方面疗效相当（P>0.05）;血浆LPS水平比较Z高组降低LPS更显着（P<0.05）;肝组织TLR4mRNA、小肠组织ZO-1mRNA、occuldin mRNA表达比较:Z高、C组降低TLR4、ZO-1mRNA、提高occuldin mRNA表达更显着（P<0.05）,Z高与C组比较无差异性（P>0.05）。结论:“温阳解毒化瘀方”通过提高肠道菌群的丰度与多样性,上调肠粘膜紧密连接蛋白的表达,调节肠粘膜通透性,降低肠源性内毒素血症及炎性反应,实现对ACLF大鼠的肠粘膜免疫稳态重建,从而抑制肝脏细胞炎性坏死,降低ACLF病死率。
段志广,朱晨辉,张婧,范代娣[8]（2017）在《相分离联合层析去除类人胶原蛋白中的内毒素》文中认为研究类人胶原蛋白（HLC）中内毒素的去除方法,为规模化制备医用生物材料提供参考。采用Triton X-114双水相分离法作为内毒素去除工艺的第1步,亲和层析法作为工艺的第2步,二者偶联操作从类人胶原蛋白中除去内毒素,并对除去内毒素后的HLC进行了理化性能检测。结果表明:采用Triton X-114双水相分离法,在蛋白质量浓度2.06 mg/m L,作用温度44.71℃,作用时间3 h,溶液pH值为7时双水相分离系数K=9.58,蛋白中内毒素含量由10 000—25 000 EU/mg下降为1.5—2.0 EU/mg,蛋白回收率为95.6%;偶联了多聚赖氨酸亲和配基的亲和层析后,HLC中内毒素含量由1.5—2.0 EU/mg降至0.025—0.25 EU/mg,蛋白回收率可达81.9%;2步操作均不会使蛋白发生相对分子质量及化学结构的改变。此工艺操作简便,可显着降低生产成本。
徐进[9]（2017）在《基于树突状细胞的多功能人工抗原提呈细胞的构建与应用》文中研究说明构建高效的人工抗原提呈细胞（artificial antigen presenting cells,aAPC）是肿瘤过继性细胞转移治疗的基础。aAPC模拟树突状细胞（dendritic cell,DC）向T细胞提呈抗原的行为,将抗原识别和共刺激因子这两类信号分子偶联到细胞或非细胞载体表面,起到体外活化T细胞的作用。随后大量扩增的T细胞被输入到肿瘤患者体内,实现肿瘤的特异性杀伤。选择细胞作为aAPC的载体,可以最大程度还原抗原提呈过程,但细胞系的选择存在诸多限制,目前可用的细胞载体存在生物安全性差、抗原分子装载困难、刺激分子数量有限等不足。基于微纳材料的aAPC可以一定程度上解决这些问题,但材料较小的尺寸一方面不利于抗原提呈,另一方面由于难靶向、易清除,使其难以在活体应用。此外,许多材料的刚性表面不利于T细胞活化过程中表面配体的流动重排,也会影响T细胞的活化。针对上述情况,本论文构建了一个基于树突状细胞的人工抗原提呈细胞体系。通过细胞的代谢合成对细胞膜上的胆碱分子进行叠氮基衍生,利用叠氮-环炔的生物正交反应将炔基化修饰的刺激分子大量共价偶联到DC表面。同时借助四氧化三铁纳米团簇的摄取对DC进行刺激,诱导树突状细胞成熟。结合上述两条策略即构建得到基于树突状细胞的多功能人工抗原提呈细胞。结果表明,DC对铁纳米团簇的摄取能够成功诱导细胞成熟表型的表达及细胞因子IL-12p70的分泌。通过细胞膜的叠氮基衍生和化学偶联,细胞表面装载大量刺激信号,提高了体外实验中该aAPC对T细胞的增殖、活化效果。此外,超顺磁性铁颗粒的内吞一方面上调趋化因子受体CCR7表达,另一方面使DC受到外加磁场操纵,增强了该人工抗原提呈细胞在体内靶向局部淋巴结的能力。最后,摄取了铁颗粒的aAPC被用来进行活体的核磁共振成像,观察到在外加磁场作用下该体系在淋巴结处能够更有效地聚集。利用DC作为载体,该体系解决了细胞型aAPC的安全性问题,同时能像微纳材料载体一样对刺激分子进行大量偶联;借助DC活化成熟的生物学过程提高其他功能性刺激、趋化因子受体表达,进一步提高了促进T细胞活化的效果及活体靶向性;最后借助材料造影剂的特性,为aAPC体内示踪提供了可能。这些进一步拓展了该人工抗原提呈细胞在活体内的应用,使其有望成为肿瘤免疫治疗的有力工具。
夏碧丽[10]（2016）在《钩体脂多糖的活性分析及TLR4受体对钩体致病性的作用研究》文中认为钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的全球广泛流行的人兽共患病。目前钩体致病机制尚未阐明。本实验采用热酚法提取钩体强毒株56606v株（v-LPS）和减毒株56606a（a-LPS）株的LPS,SDS-PAGE电泳后用Pro-Q Emerald 300染色LPS比较两者分子量差异,a-LPS与v-LPS均位于15 KDa-25 KDa之间,但a-LPS的分子量稍小于v-LPS。用ELISA和Real-time PCR检测刺激小鼠骨髓巨噬细胞产生的细胞因子表达发现a-LPS的活性较高。再用激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对各表面包裹LPS的1?m乳胶微珠的吞噬情况,发现两种LPS包被珠子的吞噬率无显着差异。另外,利用v-LPS刺激小鼠骨髓巨噬细胞表达细胞因子,发现v-LPS与已报道的L-LPS不同,其主要受体是TLR4,而不是TLR2。为了更好的研究钩体病宿主免疫反应,我们首次成功建立了钩体56606v株感染C56BL/6小鼠的急性模型,可引起小鼠黄疸和出血典型的钩体病症状。比较56606v株感染WT和TLR4-/-小鼠后的临床及病理表现。用HE染色比较两者组织病理情况以及用免疫组化观察钩体在组织的分布,另外用Real-time PCR检测在不同时间不同组织的细胞因子表达。结果显示,TLR4-/-小鼠体内钩体载量较WT小鼠高,黄疸和肝损伤相对较为严重,而WT小鼠炎症因子高表达,出血严重。综上所述,钩体致病性可能与L-LPS的结构和生物学活性差异相关。本实验首次成功建立钩体小鼠急性感染模型,证实TLR4通过介导炎症因子信号转导,有效调节宿主免疫反应和控制钩体在体内增殖,影响黄疸和肝损伤以及免疫病理引起的出血。为进一步研究脂多糖引起的信号通路以及钩体致病机制的研究提供实验基础。
二、利用多聚赖氨酸和鲎试剂检测细菌内毒素（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用多聚赖氨酸和鲎试剂检测细菌内毒素（论文提纲范文）
（1）组胺对SARA奶牛中性粒细胞粘附的影响及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 奶牛亚急性瘤胃酸中毒概述 |
| 1.1 亚急性瘤胃酸中毒 |
| 1.2 亚急性瘤胃酸中毒奶牛存在系统性炎症 |
| 1.3 SARA奶牛的系统性炎症可能由血液高LPS或组胺引起 |
| 第2章 中性粒细胞粘附与系统性炎症 |
| 2.1 中性粒细胞简介 |
| 2.2 中性粒细胞粘附级联反应 |
| 2.3 中性粒细胞在系统性炎性反应中的作用 |
| 第3章 自噬在调节中性粒细胞粘附中的作用概述 |
| 3.1 细胞自噬调控机制 |
| 3.2 自噬调控中性粒细胞粘附 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 SARA对奶牛系统性炎症和中性粒细胞粘附的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 病理浓度LPS和组胺对中性粒细胞粘附和活化的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 组胺介导奶牛中性粒细胞粘附增强的机制 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）贵州疣螈（Tylototriton kweichowensis）cathelicidin家族宿主防御肽的抗炎和伤口愈合功能及作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文章综述 |
| 1.1 宿主防御肽简介 |
| 1.2 Cathelicidin的研究进展 |
| 1.2.1 Cathelicidin的结构与分类 |
| 1.2.2 Cathelicidin的生物学活性 |
| 1.2.2.1 抗微生物活性 |
| 1.2.2.2 免疫调节活性 |
| 1.2.2.3 促进伤口愈合活性 |
| 1.2.3 Cathelicidin的表达与分布 |
| 1.3 两栖动物研究现状及在传统医药中的应用 |
| 1.4 选题依据及研究内容 |
| 1.4.1 选题依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 2 贵州疣螈cathelicidin的基因克隆及序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂(盒) |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 主要设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 cDNA文库的构建 |
| 2.2.3 贵州疣螈cathelicidin的基因克隆 |
| 2.2.4 理化性质分析方法 |
| 2.2.5 进化分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 皮肤总RNA的提取结果 |
| 2.3.2 cDNA文库的构建 |
| 2.3.3 Cathelicidin基因的扩增结果 |
| 2.3.4 菌落PCR结果 |
| 2.3.5 Cathelicidin鉴定与分析 |
| 2.3.6 理化性质分析 |
| 2.3.7 进化分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 3 贵州疣螈TK-CATH的抗炎活性及机理研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂(盒) |
| 3.1.2 主要试剂的配制 |
| 3.1.3 主要设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 TK-CATH抗大肠杆菌炎症反应 |
| 3.2.2 TK-CATH对大肠杆菌刺激的MAPKs炎症信号通路的研究 |
| 3.2.3 鲎试剂检测TK-CATH中和LPS活性 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 TK-CATH抑制炎症因子的蛋白表达 |
| 3.3.2 TK-CATH中和LPS活性 |
| 3.3.3 TK-CATH抑制MAPKs炎症通路激活 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 4 贵州疣螈TK-CATH的促进伤口愈合活性及机理研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂(盒) |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.1.4 主要设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞增殖活性 |
| 4.2.2 细胞迁移活性 |
| 4.2.3 体内伤口愈合活性检测 |
| 4.2.4 体外细胞因子分泌水平检测 |
| 4.2.5 MAPKs信号通路检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 TK-CATH能促进HaCAT的增殖和迁移 |
| 4.3.2 TK-CATH促进小鼠皮肤伤口愈合 |
| 4.3.3 TK-CATH在体外对细胞分泌的影响 |
| 4.3.4 TK-CATH对 MAPKs的影响 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 5 贵州疣螈TK-CATH的其他生物学活性研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 试剂与菌株 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 抑菌活性筛选 |
| 5.2.2 最小抑菌浓度MIC的测定 |
| 5.2.3 溶血活性测定 |
| 5.2.4 细胞毒性实验测定 |
| 5.2.5 抗氧化活性测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 抗菌活性 |
| 5.3.1.1 纸片法抑菌活性筛选 |
| 5.3.1.2 最小抑菌浓度MIC的测定 |
| 5.3.2 溶血活性 |
| 5.3.3 细胞毒性实验 |
| 5.3.4 抗氧化活性 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 论文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间主要研究成果 |
（3）两性离子水凝胶伤口敷料的研究与开发（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 皮肤创伤及伤口愈合 |
| 1.1.1 皮肤的结构组成 |
| 1.1.2 皮肤创伤概述 |
| 1.1.3 伤口愈合的过程 |
| 1.1.4 难愈合性伤口 |
| 1.2 伤口敷料的研究进展 |
| 1.2.1 湿性愈合理论 |
| 1.2.2 常见敷料的种类及其特点 |
| 1.2.3 理想敷料的特点 |
| 1.3 水凝胶伤口敷料 |
| 1.3.1 水凝胶伤口敷料的主要种类 |
| 1.3.2 抗生物粘附材料 |
| 1.3.3 两性离子材料 |
| 1.4 抗菌水凝胶 |
| 1.4.1 自身抗菌性水凝胶 |
| 1.4.2 负载抗菌剂水凝胶 |
| 1.5 本文的研究意义和研究内容 |
| 第2章 两性离子PCB水凝胶敷料用于烫伤伤口愈合的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂与材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 水凝胶的制备 |
| 2.3.2 含水量测试 |
| 2.3.3 细菌内毒素测试 |
| 2.3.4 细胞粘附测试 |
| 2.3.5 血液粘附测试 |
| 2.3.6 动物实验 |
| 2.3.7 组织学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 含水量测试 |
| 2.4.2 细胞粘附测试 |
| 2.4.3 血液粘附测试 |
| 2.4.4 动物实验结果 |
| 2.4.5 组织学分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 两性离子PCB-纳米银水凝胶敷料用于治疗伤口感染的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂与材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 含纳米银水凝胶的制备 |
| 3.3.2 含纳米银水凝胶的基本表征 |
| 3.3.3 细胞粘附测试 |
| 3.3.4 细胞毒性测试 |
| 3.3.5 细菌粘附测试 |
| 3.3.6 体外抗菌测试 |
| 3.3.7 体内抗菌测试 |
| 3.3.8 组织学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 含纳米银水凝胶的基本表征 |
| 3.4.2 细胞粘附和细胞毒性测试 |
| 3.4.3 细菌粘附测试 |
| 3.4.4 体外抗菌测试 |
| 3.4.5 动物实验和体内抗菌测试 |
| 3.4.6 组织学分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 两性离子PCB-卟啉镓水凝胶的制备和光动力杀菌的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验试剂与材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 卟啉镓化合物的合成 |
| 4.3.2 培养基的筛选 |
| 4.3.3 卟啉镓化合物的抗菌能力测试 |
| 4.3.4 PCB-卟啉镓水凝胶的制备 |
| 4.3.5 PCB-卟啉镓水凝胶的基本表征 |
| 4.3.6 PCB-卟啉镓水凝胶产自由基测试 |
| 4.3.7 PCB-卟啉镓水凝胶对生物膜的影响 |
| 4.3.8 PCB-卟啉镓水凝胶的细胞毒性测试 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 卟啉镓化合物的光谱性质 |
| 4.4.2 不同培养基中的铁元素含量 |
| 4.4.3 卟啉镓对细菌生长曲线的影响 |
| 4.4.4 卟啉镓暗反应和光动力抗菌效果 |
| 4.4.5 PCB-卟啉镓水凝胶的基本性质 |
| 4.4.6 PCB-卟啉镓水凝胶产氧自由基的性质 |
| 4.4.7 PCB-卟啉镓水凝胶对生物膜的影响 |
| 4.4.8 PCB-卟啉镓水凝胶的细胞毒性 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 多功能两性离子PCB水凝胶敷料用于糖尿病伤口监测的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验试剂与材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 多功能水凝胶的制备 |
| 5.3.2 酶活性的测定 |
| 5.3.3 酶稳定性的测定 |
| 5.3.4 葡萄糖浓度和pH值的体外测试 |
| 5.3.5 蛋白质吸附测试 |
| 5.3.6 细胞毒性测试 |
| 5.3.7 血液相容性测试 |
| 5.3.8 糖尿病小鼠模型伤口愈合和体内测试 |
| 5.3.9 组织学分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 游离酶和固定化酶的动力学参数 |
| 5.4.2 游离酶和固定化酶的稳定性 |
| 5.4.3 体外pH值的检测 |
| 5.4.4 体外葡萄糖浓度的检测 |
| 5.4.5 智能手机监测 |
| 5.4.6 蛋白吸附测试 |
| 5.4.7 细胞毒性测试 |
| 5.4.8 血液相容性测试 |
| 5.4.9 伤口葡萄糖浓度和pH值测试 |
| 5.4.10 体内伤口愈合过程 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 本文主要创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）猪内脂素重组蛋白的优化及其在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 立题背景 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 内脂素的研究进展 |
| 1.2.1.1 内脂素的起源和分子结构特征 |
| 1.2.1.2 内脂素的分布情况 |
| 1.2.1.3 内脂素对炎症反应的影响 |
| 1.2.1.4 内脂素对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 1.2.2 免疫应激的研究进展 |
| 1.2.2.1 免疫应激的作用机制 |
| 1.2.2.2 免疫应激模型的构建 |
| 1.2.2.3 免疫应激对机体的影响 |
| 1.2.3 LPS诱发免疫应激的作用机制 |
| 1.2.4 内脂素与免疫应激之间的关系 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第一部分 猪内脂素重组蛋白表达的优化及生物活性验证 |
| 1 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 Visfatin基因的扩增 |
| 1.2.2 Visfatin基因克隆菌株的构建 |
| 1.2.3 重组表达质粒的构建 |
| 1.2.4 猪内脂素重组蛋白的表达、纯化与鉴定 |
| 1.2.5 猪内脂素重组蛋白中内毒素的去除 |
| 1.2.6 猪内脂素重组蛋白生物活性验证 |
| 1.2.7 猪内脂素重组蛋白多克隆抗体的制备和验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪Visfatin基因的扩增 |
| 2.1.1 |
| 2.1.2 核酸序列分析 |
| 2.1.3 氨基酸序列分析 |
| 2.1.4 重组表达质粒的构建 |
| 2.2 猪内脂素重组蛋白表达条件的优化 |
| 2.2.1 猪内脂素重组蛋白小量表达条件优化 |
| 2.2.2 猪内脂素重组蛋白的大量表达 |
| 2.3 猪内脂素重组蛋白的内毒素去除效果检测 |
| 2.4 猪内脂素重组蛋白生物活性验证 |
| 2.4.1 猪内脂素重组蛋白对Raw264.7细胞活力的影响 |
| 2.4.2 qRT-PCR和 ELISA法检测炎症因子 |
| 2.5 猪内脂素重组蛋白多克隆抗体的验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 猪内脂素重组蛋白的原核表达 |
| 3.2 猪内脂素重组蛋白纯化条件的优化 |
| 3.3 猪内脂素重组蛋白内毒素的去除及活性验证 |
| 4 结论 |
| 第二部分 猪内脂素重组蛋白在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用 |
| 1 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验动物及处理 |
| 1.1.2 主要仪器与设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要试剂的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 样品采集和处理 |
| 1.2.2 脾脏指数测定 |
| 1.2.3 不同处理组脾内炎性细胞因子检测 |
| 1.2.4 抗氧化指标检测 |
| 1.2.5 石蜡切片的制作 |
| 1.2.6 免疫组化 |
| 1.2.7 细胞凋亡检测(TUNNEL法) |
| 1.2.8 细胞凋亡因子检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 LPS组猪临床表征和病理变化 |
| 2.2 不同处理组猪脾脏指标的变化 |
| 2.3 脾脏内炎症因子表达的变化 |
| 2.4 内脂素对断奶仔猪抗氧化功能的影响 |
| 2.5 内脂素对断奶仔猪外周免疫器官细胞增殖的影响 |
| 2.5.1 内脂素对脾脏内细胞增殖的影响 |
| 2.5.2 内脂素对肠系膜淋巴结内细胞增殖的影响 |
| 2.6 内脂素对断奶仔猪外周免疫器官细胞凋亡的影响 |
| 2.6.1 内脂素对脾脏内细胞凋亡的影响 |
| 2.6.2 内脂素对肠系膜淋巴结内细胞凋亡的影响 |
| 2.6.3 内脂素对脾内凋亡因子的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 内脂素对断奶仔猪免疫应激脾脏损伤的影响 |
| 3.2 内脂素对断奶仔猪免疫应激抗氧化功能的影响 |
| 3.3 内脂素对断奶仔脾脏和肠系膜淋巴结内细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 个人简介 |
| 附录2 论文发表情况 |
| 致谢 |
（5）多粘菌素B对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的影响及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肠道菌群失调与缺血性卒中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）乌司他丁预防重症中暑小鼠早期肠粘膜屏障功能损害的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 中暑流行病学 |
| 2 中暑与全身炎症 |
| 3 肠屏障功能与全身炎症反应 |
| 4 中暑发病与肠屏障功能的相关性研究 |
| 5 乌司他丁研究 |
| 第一部分 中暑小鼠全身炎症反应变化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 肠粘膜屏障功能损害在重症中暑小鼠早期全身炎症反应中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 乌司他丁对重症中暑小鼠早期肠粘膜屏障功能损害的保护作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（7）从肠粘膜免疫稳态重建探讨“温阳解毒化瘀方”治疗ACLF的干预机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 课题资助 |
| 引言 |
| 本实验研究技术路线图 |
| 第一部分 ACLF大鼠模型的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂、实验仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验动物造模 |
| 1.2.2 组织采样 |
| 1.2.3 HE染色病理检测 |
| 1.2.4 透射电镜观察肠粘膜超微结构 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 免疫致敏阶段 |
| 2.2 免疫攻击阶段 |
| 2.3 ACLF大鼠模型评价 |
| 2.3.1 大鼠死亡情况 |
| 2.3.2 肝脏组织病理学评估 |
| 2.3.3 肠粘膜组织学评估 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 从病理组织学探讨“温阳解毒化瘀方”对ACLF大鼠肝脏与小肠粘膜组织的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂、实验仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物分组 |
| 1.2.2 药物制备、给药剂量及给药方法 |
| 1.2.3 标本采样 |
| 1.2.4 HE染色病理检测 |
| 1.2.5 透射电镜观察肠粘膜超微结构分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.0 大鼠一般情况分析 |
| 2.1 各实验组大鼠肝脏组织病理学比较 |
| 2.2 各实验组大鼠小肠粘膜组织病理学比较 |
| 2.3 各实验组大鼠小肠粘膜组织超微结构比较 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 基于高通量测序技术研究“温阳解毒化瘀方”对ACLF大鼠肠道菌群特征的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器和设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物分组 |
| 1.2.2 给药剂量及给药方法 |
| 1.2.3 粪便标本采样 |
| 1.2.4 大鼠粪便样本肠道菌群的DNA提取 |
| 1.2.5 PCR扩增 |
| 1.2.6 Illumina Miseq测序 |
| 1.2.7 数据处理 |
| 1.2.8 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 大鼠肠道菌群16S rRNA高通量焦磷酸测序结果序列分析 |
| 2.1.1 测序数据的处理 |
| 2.1.2 物种组成分析 |
| 2.1.3 组间OTU差异显着性分析 |
| 2.1.4 样本共有物种分析 |
| 2.1.5 alpha多样性指数分析 |
| 2.1.6 肠道菌群整体结构分析 |
| 2.1.7 Beta多样性指数分析 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第四部分 从免疫炎症因子功能变化探讨“温阳解毒化瘀方”对ACLF大鼠肠粘膜免疫功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂、实验仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物分组 |
| 1.2.2 给药剂量及给药方法 |
| 1.2.3 标本采样 |
| 1.2.4 指标检测 |
| 1.2.5 统计方法 |
| 2.结果与分析 |
| 3.讨论 |
| 第五部分 全文讨论 |
| 结论 |
| 本研究的创新、不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述“肠-肝”轴:ACLF患者中的细菌易位,炎症和肠粘膜免疫 |
| 1.背景 |
| 2.ACLF中的“肠-肝”轴功能异常机制 |
| 2.1 .肠道黏膜免疫 |
| 2.2 .肠道细菌易位激活先天性免疫系统 |
| 2.3 .肠道菌群相关的炎症反应 |
| 3.以“肠-肝”轴为理论依据,ACLF的治疗策略 |
| 3.1 .激活肠DC对肠黏膜屏障功能的保护作用 |
| 3.2 .肠道微生态重建 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文、参与课题及获奖情况 |
（8）相分离联合层析去除类人胶原蛋白中的内毒素（论文提纲范文）
| 1 实验 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 蛋白质量浓度对双水相分离效果的影响 |
| 1.2.2 作用温度对双水相分离效果的影响 |
| 1.2.3 作用时间对双水相分离效果的影响 |
| 1.2.4 溶液p H值对双水相分离效果的影响 |
| 1.2.5 响应面法分析 |
| 1.2.6 亲和层析 |
| 1.2.7 类人胶原蛋白理化性质检测 |
| (1) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 |
| (2) 紫外可见光光谱分析 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 蛋白 (HLC) 质量浓度对双水相分离效果的影响 |
| 2.2 作用温度对双水相分离效果的影响 |
| 2.3 作用时间对双水相分离效果的影响 |
| 2.4 溶液p H值对双水相分离效果的影响 |
| 2.5 响应曲面优化分析 |
| 2.6 相分离法与亲和层析偶联操作 |
| 2.7 类人胶原蛋白理化性能检测 |
| (1) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 |
| (2) 紫外可见光光谱分析 |
| 3 结论 |
（9）基于树突状细胞的多功能人工抗原提呈细胞的构建与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤的免疫治疗 |
| 1.1.1 人体免疫系统 |
| 1.1.2 肿瘤免疫与免疫治疗 |
| 1.2 树突状细胞及肿瘤疫苗 |
| 1.2.1 树突状细胞及抗原提呈 |
| 1.2.2 肿瘤疫苗的研究与发展 |
| 1.2.3 树突状细胞与佐剂材料的相互作用 |
| 1.3 人工抗原提呈细胞 |
| 1.3.1 过继性细胞转移治疗与人工抗原提呈细胞 |
| 1.3.2 基于细胞的人工抗原提呈细胞 |
| 1.3.3 非细胞型人工抗原提呈细胞 |
| 1.4 核磁共振成像在生物医学中的应用 |
| 1.5 课题研究的内容及意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究意义 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.2 骨髓来源树突状细胞的提取与培养 |
| 2.2.1 骨髓来源树突状细胞(BMDC)的提取与培养 |
| 2.2.2 BMDC的叠氮基衍生 |
| 2.2.3 BMDC的刺激活化 |
| 2.3 树突状细胞的叠氮基衍生验证 |
| 2.3.1 BMDC叠氮基衍生的共聚焦荧光验证 |
| 2.3.2 BMDC叠氮化修饰的流式验证 |
| 2.3.3 CellTiter-Blue?细胞活性试剂盒检测乙基叠氮胆碱对DC的毒性 |
| 2.4 抗体分子的环炔化修饰 |
| 2.4.1 抗体分子的环炔化修饰 |
| 2.4.2 环炔化抗体反应性的验证 |
| 2.5 氧化铁团簇纳米颗粒对BMDC的活化验证 |
| 2.5.1 材料内毒素测定 |
| 2.5.2 DC表面分子表达测定 |
| 2.5.3 Fixable Viability Dye eFluor?780 检测氧化铁团簇对DC的毒性 |
| 2.5.4 ELISA检测细胞因子分泌 |
| 2.5.5 DC内吞氧化铁团簇超薄切片 |
| 2.5.6 DC内吞氧化铁团簇共聚焦验证 |
| 2.5.7 DC内吞氧化铁团簇流式验证 |
| 2.5.8 DC活化伪足形态变化的共聚焦成像 |
| 2.6 DC-aAPC载体构建 |
| 2.6.1 Click反应构建DC-aAPC |
| 2.6.2 aAPC构建共聚焦表征 |
| 2.6.3 亲和素磁珠偶联生物素抗体 |
| 2.6.4 流式测定磁珠/细胞的荧光强度 |
| 2.7 DC-aAPC载体免疫反应检测 |
| 2.7.1 小鼠脾脏淋巴细胞的提取 |
| 2.7.2 CD8+T细胞的分离纯化 |
| 2.7.3 混合淋巴细胞反应 |
| 2.8 DC-aAPC的活体实验 |
| 2.8.1 aAPC靶向性的荧光成像 |
| 2.8.2 aAPC用于体外核磁共振成像(Phantom Tube) |
| 2.8.3 aAPC的体内核磁共振成像 |
| 2.8.4 aAPC在淋巴结内分布的组织切片 |
| 第3章 基于树突状细胞抗原提呈细胞的构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 DC的叠氮基团衍生 |
| 3.2.2 抗体的DBCO-化修饰 |
| 3.2.3 DC与氧化铁团簇的相互作用 |
| 3.2.4 氧化铁团簇对DC的活化诱导 |
| 3.2.5 DC-aAPC载体构建 |
| 3.2.6 DC-aAPC对T细胞的体外扩增 |
| 3.2.7 DC-aAPC的活体靶向 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文与研究成果清单 |
| 致谢 |
（10）钩体脂多糖的活性分析及TLR4受体对钩体致病性的作用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词简表(ABBREVIATIONS) |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 钩端螺旋体 |
| 1.2 钩端螺旋体脂多糖 |
| 1.2.1 L-LPS的结构特点 |
| 1.2.2 钩体O-抗原基因簇 |
| 1.2.3 L-LPS生物学活性 |
| 1.2.4 L-LPS在预防钩体病中的作用 |
| 1.3 钩体感染的动物模型 |
| 1.3.1 钩体急性感染的动物模型 |
| 1.3.2 钩体慢性感染的动物模型 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 不同毒力钩体脂多糖的生物活性分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验菌株 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.2.5 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 钩体的培养和处理 |
| 2.3.2 透析袋预处理 |
| 2.3.3 L-LPS的提取 |
| 2.3.4 苯酚硫酸法定量多糖 |
| 2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.3.6 考马斯亮蓝染色 |
| 2.3.7 Pro-Q?Emerald300荧光染色 |
| 2.3.8 钩体固定计数 |
| 2.3.9 鲎试剂-内毒素检测 |
| 2.3.10 小鼠基因型鉴定 |
| 2.3.11 小鼠骨髓巨噬细胞的制备 |
| 2.3.12 ELISA定量细胞因子表达 |
| 2.3.13 RNA的提取和纯化 |
| 2.3.14 Real-time PCR检测 |
| 2.3.15 激光共聚焦显微镜观察细胞吞噬 |
| 2.3.16 LPS-beads包被及检测 |
| 2.3.17 激光共聚焦显微镜观察细胞对包被珠子的吞噬率 |
| 2.3.18 统计方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 定量L-LPS |
| 2.4.2 L-LPS的 SDS-PAGE图谱 |
| 2.4.3 钩体LPS的鲎试剂凝集活性较低 |
| 2.4.4 L-LPS刺激BMDMs产生细胞因子 |
| 2.4.5 激光共聚焦显微镜观察小鼠骨髓巨噬细胞吞噬钩体 |
| 2.4.6 L-LPS包被beads |
| 2.4.7 激光共聚焦显微镜观察BMDMs对 a-LPS和 v-LPS包被珠子的吞噬情况 |
| 2.4.8 小鼠基因型鉴定PCR扩增 |
| 2.4.9 L-LPS能抑制大肠埃希菌脂多糖刺激BMDMs的细胞因子表达 |
| 2.4.10 v-LPS刺激小鼠BMDMs细胞因子产生的主要受体是TLR4,而不是TLR2 |
| 2.4.11 TLR4 受体不影响BMDMs对钩体的吞噬 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 钩端螺旋体小鼠急性感染模型的建立以及TLR4 在钩体感染固有免疫中的作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 钩端螺旋体菌株的培养及处理 |
| 3.3.2 实验动物感染及检测 |
| 3.3.3 血液和组织RNA的提取 |
| 3.3.4 组织石蜡包埋和HE染色 |
| 3.3.5 免疫组化Envision二步法染色 |
| 3.3.6 统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 小鼠感染不同菌株钩体的大体病变 |
| 3.4.2 WT和 TLR4~(-/-)小鼠感染钩体后的大体观察 |
| 3.4.3 肝功能检测 |
| 3.4.4 组织病理HE染色 |
| 3.4.5 钩体在脏器中的分布 |
| 3.4.6 Real-time PCR检测钩体在小鼠血液和各个组织的分布以及相关细胞因子的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
四、利用多聚赖氨酸和鲎试剂检测细菌内毒素（论文参考文献）
- [1]组胺对SARA奶牛中性粒细胞粘附的影响及机制[D]. 李云飞. 吉林大学, 2021
- [2]贵州疣螈（Tylototriton kweichowensis）cathelicidin家族宿主防御肽的抗炎和伤口愈合功能及作用机理研究[D]. 罗暄巾. 贵州师范大学, 2021(09)
- [3]两性离子水凝胶伤口敷料的研究与开发[D]. 朱迎男. 天津大学, 2020(01)
- [4]猪内脂素重组蛋白的优化及其在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用[D]. 李慧珍. 华中农业大学, 2020
- [5]多粘菌素B对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的影响及机制的研究[D]. 龙似维. 锦州医科大学, 2020(05)
- [6]乌司他丁预防重症中暑小鼠早期肠粘膜屏障功能损害的实验研究[D]. 曹才文. 南方医科大学, 2019(09)
- [7]从肠粘膜免疫稳态重建探讨“温阳解毒化瘀方”治疗ACLF的干预机制[D]. 张涛. 湖南中医药大学, 2019
- [8]相分离联合层析去除类人胶原蛋白中的内毒素[J]. 段志广,朱晨辉,张婧,范代娣. 化学工程, 2017(10)
- [9]基于树突状细胞的多功能人工抗原提呈细胞的构建与应用[D]. 徐进. 北京理工大学, 2017(03)
- [10]钩体脂多糖的活性分析及TLR4受体对钩体致病性的作用研究[D]. 夏碧丽. 浙江工业大学, 2016(05)