运动蛋白基因介导的植物病毒细胞间运动和抗病性研究进展

运动蛋白基因介导的植物病毒细胞间运动和抗病性研究进展

一、植物病毒细胞间运动及运动蛋白基因介导的抗病性研究进展(论文文献综述)

吴昕扬[1](2021)在《NbFLA34和NbHRLI4基因在芜菁花叶病毒侵染过程中的功能研究》文中指出植物病毒是严重危害农产品安全生产的生物因子,严重影响农产品的产量、品质,造成巨大的经济损失。马铃薯Y病毒属(genus Potyvirus)是植物病毒中最大的属,而芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是其中危害较为严重的病毒之一。在植物病毒侵染寄主的过程中,寄主基因能够以不同的方式,调控寄主对病毒的抗性,从而抑制病毒侵染。挖掘、了解这些抗性基因在病毒侵染过程中的作用及其机制,有助于我们更好地理解病毒-植物互作关系,为植物抗病性的研究与调控提供理论基础。6K2是Tu MV的非结构蛋白,是病毒复制、病毒囊泡成熟等所必需的。在前期,对Tu MV 6K2蛋白进行酵母文库筛选的基础上,我们发现一个本氏烟类成束阿拉伯半乳糖蛋白(Fasciclin-like arabinogalactan,FLA)Niben101Scf12431g00010.1与6K2互作,将其命名为Nb FLA34。FLA类蛋白含主要参与纤维素沉积、细胞壁合成以及盐胁迫等过程。对本氏烟FLA家族进行系统鉴定发现,Nb FLA家族可分为4个亚类,在进化上每个亚类相对保守,且大部分Nb FLA成员在Tu MV侵染后下调表达。Nb FLA34属于亚类III,它的GPI锚定位点以及6K2的Gxxx G基序是二者互作的关键位点。Tu MV侵染能显着地下调Nb FLA34的转录本水平。沉默Nb FLA34后,寄主对于Tu MV的感病性增加,而过表达Nb FLA34能够抑制Tu MV的积累。但突变Nb FLA34 C端GPI后对Tu MV的抑制能力减弱。Nb FLA34依赖于6K2中Gxxx G基序与6K2互作,该基序也是6K2自身互作的关键位点。进一步研究发现,Nb FLA34能够以互作依赖的方式干扰6K2的自身互作,从而抑制6K2诱导的病毒囊泡的聚集和胞间连丝靶向。综上所述,本研究揭示了Nb FLA34通过干扰6K2的自身互作,影响病毒囊泡的功能,从而赋予寄主对Tu MV的抗病能力。同时,我们对Tu MV侵染本氏烟后进行转录组测序,筛选到了差异下调的类过敏反应病变诱导(HR-like lesion inducing,HRLI)基因成员Nb HRLI4。HRLI类基因是一类未被鉴定的内源基因,可能参与细胞坏死过程。沉默Nb HRLI4促进了病毒的侵染,并下调了SA途径基因的表达量。外源喷施SA能够减缓沉默Nb HRLI4后导致的感病性。而瞬时表达Nb HRLI4能够抑制病毒的积累,且令SA途径基因的表达量上调。单独瞬时表达Nb HRLI4能够诱导类HR细胞坏死,但在转Nah G基因的植物中细胞坏死程度降低,表明Nb HRLI4可能以SA依赖的方式诱导细胞死亡。同时,我们也发现Nb HRLI4与Tu MV-P3互作,突变互作关键位点后抑制了细胞坏死。综上所述,本研究揭示了Nb HRLI4通过SA介导的方式诱导细胞坏死从而调控寄主的基础免疫途径。这些研究对深入了解寄主组分参与对植物病毒的抗病过程有重要的价值。

刘敏[2](2020)在《蛋白酶抑制子NbSIPI6在植物抗PVY病毒中的作用》文中认为植物病毒病由于严重影响作物正常生长发育,发病后又难以防治,造成巨大经济损失,如何有效防治病毒病一直是制约农业生产的重要问题。病毒在侵染寄主植物后,需利用寄主组分,进行复制和移动,因此如何抑制其复制与移动是防治植物病毒病的两个重要环节。植物蛋白酶抑制子(Plant Protease Inhibitor,PPI)是植物重要的防御组分,调控植物对病、虫与草等的抗性,但PPI对病毒的抗性研究还相对较少。NbSIPI6是一个被胁迫诱导表达的大豆胰蛋白酶抑制子家族成员,实验室前期研究发现烟草NbSIPI6可抑制PVX病毒的长距离移动,增强本氏烟对PVX的抗性。本实验想进一步探究NbSIPI6是否拮抗PVY,以此丰富PPI类基因对抗病毒的认识。本实验利用NbSIPI6融合GFP的转基因材料,分析NbSIPI6本氏烟对PVY病毒的抗性,并为亚细胞定位和后续免疫沉淀提供基础。此外,分析了NbSIPI6响应病毒与水杨酸(Salicylic acid,SA)的表达模式以及NbSIPI6对病毒基因沉默抑制子活性的影响,为探索蛋白酶抑制子在抗病毒中的相关作用机制提供依据。主要研究结果如下:1.构建NbSIPI6 C端超表达载体与关键氨基酸点突变NbSIPI6m融合GFP载体,遗传转化本氏烟。经GFP检测和Hyg抗生素筛选,分别获得3株与7株独立阳性株系。通过实时荧光PCR检测,发现阳性株系中NbSIPI6表达量明显高于野生型2.蛋白质发挥作用需要正确折叠为前提,有时融合蛋白会影响蛋白质正确折叠而使靶蛋白丧失功能。因此拟通过验证NbSIPI6-GFP转基因植株是否具有抗病毒功能,来确证转基因植物材料的可用性。利用获得的T1代转基因材料,接种PVX-INF1和PVY,与突变株系和野生型相比,超表达NbSIPI6-GFP植株显着抑制了病毒的扩散,抗病毒能力明显提高。这说明,NbSIPI6 C端融合GFP不改变NbSIPI6抑制病毒移动的功能,可以用于后续研究;第二,NbSIPI6对病毒抑制不仅局限于PVX,也可提高对PVY的抗性。3.为明确NbSIPI6的细胞定位,将质膜Marker mCherry在NbSIPI6-GFP超表达株系叶片中瞬时表达,激光共聚焦检测发现,(1)瞬时表达部分区域呈现黄色,表明NbSIPI6与mCherry重合,即定位于细胞膜;(2)在细胞内其它区域还有清晰的绿色呈现,表明NbSIPI6不仅存在于细胞质膜,在细胞其他区域也有分布;(3)水杨酸或PVX处理后,NbSIPI6表达量显着高于对照,说明NbSIPI6的表达能够响应水杨酸与PVX。4.基因沉默是植物抵御病毒的重要方式,病毒常常利用基因沉默抑制子来抑制植物的基因沉默作用。因此我们想探究NbSIPI6是否具有拮抗病毒沉默抑制子功能。将实验室前期构建的NbSIPI6-1300和NbSIPI6m-1300等超表达载体分别与病毒沉默抑制子Hc-Pro和P19组合,再与GFP-1300共注射16c本氏烟,通过检测绿色荧光有无和强度,评价NbSIPI6对沉默抑制子的作用。研究发现,NbSIPI6与Hc-Pro或P19组合中,绿色荧光呈现出与注射Hc-Pro/P19沉默抑制子的相似强度,推测NbSIPI6可能不具有抑制病毒沉默抑制子。

杨雪[3](2019)在《NbH2B和NbFD1基因在马铃薯X病毒侵染过程中的功能研究》文中提出植物病毒是一类重要的植物病原,对农作物造成严重危害,导致巨大经济损失。病毒在侵染过程中,植物体内的多种抗性途径也会发挥作用,抑制病毒的侵染,减轻病害的严重程度。进一步发掘植物体内参与抗性途径或者辅助病毒侵染的寄主成分对于了解病毒—植物相互作用、提出新型抗病策略具有重要意义。在前期对马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)侵染本氏烟(Nicotiana Benthamiana)后病毒编码的p25蛋白pull-down)质谱分析数据的基础上,对候选的本氏烟组蛋白H2B和铁氧化还原蛋白(ferredoxin 1,FD1)深入开展了其在病毒侵染过程中的功能研究。组蛋白H2B是组成染色体的重要成分,而且参与了翻译后修饰作用来调控基因表达,包括植物对病原体的免疫反应。本研究中,我们发现PVX侵染导致了本氏烟中H2B的mRNA和蛋白质水平的降低。利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导病毒诱导基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)来系统沉默H2B,于对照相比沉默H2B不影响TRV滴度。在H2B沉默的植株上接种PVX后发现病毒系统侵染率明显降低。并且H2B沉默的植株上观察到叶片发育异常和叶柄坏死,但是当在SA积累缺陷型的NahG转基因本氏烟植株上沉默H2B后叶柄坏死可以得到缓解,这说明水杨酸(Salicylic acid,SA)参与了该症状的产生。进一步通过实时荧光定量 PCR(quantitative reverse transcription(qRT)-PCR,qRT-PCR)和液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectroscopy,LC-MS)检测表明,H2B沉默后植株内SA积累增加。为了进一步验证该结果,我们选取了三个SA合成途径基因ICS1、PAL2、EDS5和H2B共沉默,结果显示阻断SA合成后可以缓解H2B沉默的植株上的叶柄坏死,这与NahG植株上结果一致。这些结果说明了,H2B的沉默导致了内源性SA的积累,这与植株叶柄坏死和对PVX侵染抗性产生密切相关。叶绿体是一些植物病毒侵染并靶向的主要细胞器,在侵染过程中叶绿体会发生结构变化和功能紊乱从而在某种程度上有利于病毒的侵染。目前,病毒靶向叶绿体蛋白促进病毒侵染的机制仍然有待补充和深入研究。本研究中,我们发现PVX编码的p25蛋白能与本氏烟中叶绿体定位铁氧还蛋白发生相互作,同时PVX侵染或者p25的表达都可以降低FD1的表达和蛋白积累。利用TRV介导的VIGS对FD1的沉默促进了 PVX在植物中局部或者系统性的运动。我们运用DANS和苯胺蓝染色方法检测叶片胞间连丝(plasmodesmata,PD)中胼胝质含量,结果显示沉默FD1使PD上胼胝质积累水平降低,渗透性增加。进一步研究发现,沉默FD1降低了植株激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)和SA的含量,这可能是沉默FD1植株上胼胝质积累量降低的原因。外源施加ABA和SA可以部分恢复FD1沉默所引起的PD上胼胝质积累量的降低。FD1过表达转基因植株对PVX产生抗性作用,而ABA、SA和PD上胼胝质的积累在FD1转基因植株上均无变化。同时,我们发现过表达FD1会干扰p25蛋白的沉默抑制子功能,这可能是导致FD1转基因植株抗PVX侵染的原因。这些结果显示FD1参与了 PVX侵染本氏烟的过程。综上所述,本研究揭示了组蛋白H2B通过负向调控SA途径参与了植物抗病毒侵染过程;FD1通过调节多种植物生理生化途径参与了病毒侵染植物的过程。这些研究对深入了解病毒—植物相互作用的机制有重要的价值。

杨锦[4](2019)在《中国小麦花叶病毒(CWMV)外壳蛋白(CP)磷酸化及其作用机理研究》文中认为中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是20世纪90年代本实验室在山东冬小麦上鉴定的一种新的土传病毒,是引起我国小麦花叶病毒病的重要病原之一。该病毒病侵染的小麦植株一般都表现出黄花叶的症状,但其具体的致病机理尚不清楚。本研究利用农杆菌介导的转化方法,获得过表达CWMV外壳蛋白(CP)的本氏烟植株(OECP),并利用亚细胞定位、蛋白修饰分析、酵母双杂交系统和病毒介导的基因沉默技术等初步解析了CP蛋白在病毒侵染时的功能及其作用机理。具体研究结果如下:1、本实验共获得4个高表达OECP株系,并且OECP植株表现出了明显的花叶与矮化现象。通过测定转基因植株的光合速率后发现过表达CP蛋白基因会导致烟草植株净光合速率显着降低,说明CP蛋白可抑制寄主植株的光合途径。同时,OECP接毒CWMV后,发现CWMV的MP基因表达量显着降低,该结果说明在烟草中表达CP基因可提高寄主的抗病性。2、亚细胞定位和免疫胶体金实验表明CP蛋白特异的定位于寄主的叶绿体中,并且CP蛋白N端1-87个氨基酸处对CP蛋白的定位起到决定作用。然而,生物信息学预测CP蛋白并不包含叶绿体信号肽。通过蛋白质质谱分析,发现CP蛋白N端含有两个磷酸化位点,分别是45、55位点的丝氨酸(S45、S55)。对这两处的丝氨酸突变后进行亚细胞定位分析发现,突变的CP蛋白不能定位于叶绿体中。该实验表明CP蛋白N端的S45与S55参与CP蛋白的亚细胞定位,并起到决定作用。3、以CP蛋白为诱饵蛋白,在烟草cDNA文库进行筛选发现了一个叶绿体相关蛋白NbPSID2,进一步通过酵母双杂交系统发现CP蛋白与NbPSID2存在互作关系。利用病毒介导的基因沉默技术在烟草中瞬时沉默了Nb PSID2,且沉默植株叶片表现为褪绿现象,表明NbPSID2参与烟草植株的光合作用。综上所述,本研究结果为培育小麦抗病材料奠定了工作基础,同时为系统解析CP蛋白在CWMV侵染过程中的作用机理奠定基础。

钱新[5](2019)在《番茄斑萎病毒胞间移动和抗病蛋白Sw-5b抑制病毒移动的机制研究》文中进行了进一步梳理番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是一种三分体负义链RNA病毒,被认为是最具毁灭性的植物病毒之一,每年造成的农作物经济损失达10亿美元,近年来在我国西南等地区广泛流行,并进一步向全国蔓延。TSWV编码的移动蛋白帮助病毒移动和侵染,但是有关病毒移动所需的宿主因子的报道很少。番茄抗病蛋白Sw-5b对TSWV具有免疫作用,但Sw-5b是否对TSWV的移动具有直接的抑制作用以及相应的抑制机制依然知之甚少。为探索这些重要科学问题,本论文主要集中在以下两个方面开展了研究:1.分子共伴侣SGT1对番茄斑萎病毒在本氏烟中的胞间移动和系统侵染具有重要调控作用植物体内病毒的成功侵染需要多种宿主因子。迄今为止,番茄斑萎病毒在植物侵染过程中只有少数宿主因子被鉴定出来起重要调控作用。我们早先研究表明番茄斑萎病毒编码的移动蛋白NSm在病毒的胞间和长距离运动中起着关键作用。在本研究中,鉴定了番茄斑萎病毒NSm与分子共伴侣蛋白NbSGT1具有相互作用,TSWV侵染本氏烟显着上调NbSGT1基因的表达。过量表达NbSGT1加速了 TSWV的侵染,相反,使用病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法沉默NbSGT1基因表达强烈抑制了 TSWVNSm的胞间移动,并抑制TSWV在本氏烟植株中的局部和系统侵染。此外,发现NbSGT1对美洲型和亚洲型番茄斑萎病毒的侵染均有正调控作用。综上所述,本研究的结果及先前发表的研究结果表明了分子共伴侣蛋白NbSGT1在调节植物正链RNA病毒和三分体负义链RNA病毒侵染中都有着重要作用。2.番茄抗病蛋白Sw-5b抑制病毒移动的机制研究为了解析番茄抗病蛋白Sw-5b对番茄斑萎病毒的抗病机制,本研究对Sw-5b是否对番茄斑萎病毒移动蛋白NSm具有抑制作用进行了测定,发现Sw-5b可以直接抑制移动蛋白NSm的胞间移动,并且在Sw-5b存在时NSm定位到胞间连丝的数量显着降低。为了阐明其潜在的分子机制,本研究通过转录组分析发现Sw-5b被激活后,与植物细胞壁扩张相关的基因大规模下调,而这些基因的下调直接抑制了病毒的胞间移动。为了进一步了解其中的分子调控机制,我们通过对细胞壁相关基因的分析发现这些细胞壁基因的启动子区域存在WRKY转录因子结合位点。转录组数据表明,Sw-5b在NSm的作用下激活后确实引起了 WRKYs基因的上调,利用凝胶阻滞迁移试验发现WRKYs转录因子确实与细胞壁相关基因的启动子发生结合,通过瞬时转录表达试验得知过表达WRKYs抑制细胞壁相关基因的表达,表明WRKYs转录因子负调控细胞壁基因。同时本研究还发现Sw-5b诱导的WRKYs转录因子的上调依赖茉莉酸途径,但不依赖水杨酸途径。通过病毒诱导的基因沉默技术,发现沉默WRKYs转录因子后,Sw-5b抵抗番茄斑萎病毒侵染的能力丧失,表明WRKYs转录因子在Sw-5b介导的抗病反应中发挥重要调控作用。综上所述,本研究揭示了 Sw-5b抗病蛋白激活后WRKYs调控细胞壁相关基因下调并介导对番茄斑萎病毒的抗性的分子机制。

赵兴[6](2019)在《毒氟磷与马铃薯X病毒侵染关系研究及致病因子p25互作蛋白筛选》文中提出毒氟磷(Dufulin)是中国自主研发的新型植物抗病毒剂,目前被广泛应用于预防和控制南方水稻黑条纹矮病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)。在抗SRBSDV的研究中表明,毒氟磷因具有较强的内吸作用,与病毒外壳蛋白结合(coat protein,CP)破坏病毒外壳使病毒无法增殖,同时其通过激活水杨酸信号分子进而激活下游的植物防御因子,提高作物系统抗病性,从而表现出良好的抗病毒活性。马铃薯X病毒(potato virus x,PVX)为马铃薯X病毒属代表成员,基因组由一条正单链RNA分子组成,长度约6.4 kbp,其含有5个开放阅读框(ORF),分别编码166 k Da的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,Rd Rp)、25 k Da的TGBp1蛋白、12 k Da的TGBp2蛋白、8 k Da的TGBp3蛋白和25 k Da的病毒外壳蛋白。自然条件下PVX主要依靠摩擦进行机械传播,常与其他植物病毒(如potato virus y,PVY)复合侵染,对作物造成严重病毒病害。在本课题中,我们针对毒氟磷对PVX是否具有防治作用展开了相关研究。首先对健康的本氏烟植株进行毒氟磷的预处理,以水处理为对照,在处理后2天接种带绿色荧光标记的PVX-GFP,PVX的发病进程表明,毒氟磷预处理的植株发病延迟,通过实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative,PCR)和免疫印迹法(Western Blot)检测到毒氟磷预处理组PVX积累量明显降低,说明毒氟磷对PVX的侵染具有一定的预防作用。而在PVX已经侵染的植株上用毒氟磷处理后,实验结果表明病毒的积累量无明显变化,表明毒氟磷对PVX的治愈效果不明显。为了进一步解决治愈PVX侵染的问题,我们通过GFP磁珠共沉淀,筛选与PVX致病因子p25相互作用的蛋白,尝试从蛋白互作的策略出发阻断p25的功能。通过质谱鉴定,我们初步筛选到了20个可能与致病因子p25互作的植物寄主蛋白。通过双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术深入分析了本氏烟SGS3基因和病毒侵染的关系。综上所述,本实验通过研究毒氟磷对PVX侵染的影响,明确了毒氟磷对PVX具有预防作用,为后期揭示毒氟磷抵抗PVX机制研究提供生物学基础。同时通过GFP磁珠共沉淀初步筛选到20个与PVX致病因子p25相互作用的候选蛋白本,为后续从蛋白互作策略阻断p25功能研究奠定基础。

苗艳梅[7](2019)在《赤爮花叶病毒外壳蛋白基因对马铃薯的转化及其抗病性初步分析》文中研究表明植物病毒病作为阻碍植物生长发育的第二大疾病,严重影响我国农业经济增长与发展。近年来,随着基因工程技术的发展,植物病毒病的防治效果显着,其中由病毒外壳蛋白(coat protein简称CP)介导植物获得相应病毒抗性的方法相对成熟且效果较好,然而由于植物病毒种类繁多,不同病毒CP基因介导抗性范围和效果也各不相同。本实验选择2017年首次被发现并报道的的赤爮花叶病毒(Thladianrha dubia mosaic virus简称ThDMV)的CP作为研究对象,以期为植物病毒病抗病研究添加新成员,同时为进一步了解ThDMV CP功能打下基础。本研究以野生赤爮叶片为材料提取总RNA,根据已有的ThDMV病毒序列设计特异性引物利用RT-PCR技术经琼脂糖凝胶电泳检测得到大小约为800bp的ThDMV CP基因目的条带,将目的基因纯化回收测序正确,获得ThDMV CP分离物。根据获得的 ThDMV CP 序列信息与 pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pGreen-35s多克隆位点信息,设计引物对ThDMV CP添加酶切位点,利用及BamHI和HindⅢ双酶切连接,成功构建重组植物内表达载体pCAMBIA1301-CP、pCAMBIA1300-CP、pGreen-35sCP。在农杆菌LBA404介导下,将ThDMV CP导入马铃薯叶片,利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization 简称 FISH)、全组织杂交技术对 ThDMV CP 基因在植物叶片内进行定位分析发现ThDMV CP在植物内分布分散。进一步,以侵染重组植物内表达载体pCAMBIA1301-CP的植物叶片做实验材料进行粗酶液的提取,检测植物防御性酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT)在观察5天内活性变化情况。结果显示:在观察的5天内,SOD、POD和CAT都有不同程度的升高,初步判断ThDMV CP对马铃薯的抗性具有一定作用。进一步,利用摩擦接种的方式对侵染重组植物内表达载体pCAMBIA1301-CP的植物接种PVY病毒,利用实时荧光定量PCR检测技术(Quantitative Real-time PCR简称QPCR)检测ThDMV CP介导的马铃薯对PVY具有一定抗性。

吴伟文[8](2019)在《实时荧光定量和等温核酸扩增检测莲藕潜隐病毒技术的建立与应用》文中研究说明莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)是睡莲科莲属多年生宿根水生草本植物,是我国重要的特色水生蔬菜。莲藕中含有丰富的营养物质,受到国内外消费者的喜爱。在我国莲藕主产区,发生地下茎瘦小僵硬、表面出现深入皮层的黑褐色点斑和条斑的“僵藕”问题,前期研究表明,“僵藕”极有可能是由病毒侵染引起的。目前,已报道的在莲藕上发生的病毒主要有:莲藕潜隐病毒(暂定名)(Lotus latent virus,LLV),黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、莲藕条斑病毒(Lotus streak virus),芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)和苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)。本实验室前期在对上述病毒的初步研究中发现LLV的发生最普遍,分布最广泛,但该病毒的稳定的检测技术尚未建立。为此,本论文研究了基于实时荧光定量和等温核酸扩增的该病毒的检测技术体系,并利用该检测技术研究了 LLV在莲藕中的分布。主要结果如下:1、建立了 RT-qPCR、LAMP和RPA 3种LLV检测体系,其中,RT-qPCR检测体系灵敏度最高,最低检测限度为7×101拷贝.μl-1,是RT-PCR的100倍,适用于脱毒莲藕种苗的检测鉴定;LAMP检测体系最低检测限度为7×103拷贝·μl-1,与RT-PCR一致,且具有可视化特点,适用于田间诊断;RPA检测体系反应时间短,速度快,最低检测限度为7x103拷贝·μl-1,可作为大量莲藕样品检测时的有效手段。2、利用灵敏度最高的RT-qPCR检测技术,分别对“僵藕”样品不同部位进行LLV定量检测。结果发现,LLV在“僵藕”顶芽后第一节地下茎中浓度最高,并且逐节递减。对“僵藕”做种后新结莲藕的地下茎的表皮层、气孔周围基本组织、维管束组织以及中央薄壁细胞的检测发现,在维管束和气孔周围基本组织中LLV的浓度显着高于表皮层及中央薄壁细胞。

温雪玮[9](2018)在《杀菌剂对水稻条纹叶枯病毒侵染水稻的影响及水杨羟肟酸处理水稻和油菜叶片的转录组分析》文中研究说明近年来,由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病(Rice stripe disease)在我国众多稻区爆发,对粳稻区的危害尤为严重。灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)是水稻条纹病毒的主要传播介体。灰飞虱的迁飞和爆发直接影响水稻条纹叶枯病的发生与流行。而灰飞虱的迁飞受众多环境因素的影响,导致病害的防治极为被动。内吸性杀菌剂常用于水稻上多种真菌病害的防治,能够被水稻吸收并传递到全株。推测灰飞虱迁飞到施用过内吸性杀菌剂的水稻上取食,可能会对其自身及病害的发生产生影响。本研究选用了水稻上常用的5种不同作用机理的内吸性杀菌剂(多菌灵、三环唑、嘧菌酯、丙环唑、噻呋酰胺)通过浸根预先处理水稻2-3叶期幼苗,再接种不同虫龄的不带病毒灰飞虱和带病毒灰飞虱,发现不同杀菌剂对带病毒和不带病毒灰飞虱产生的影响不同,其中施用三环唑的水稻对于各类型灰飞虱的取食忌避性、成虫产卵忌避性和致死率的影响较其他杀菌剂更广泛。但这几种杀菌剂仅在高浓度下才有对灰飞虱有影响,浓度远高于田间使用浓度。这说明在田间使用浓度下这几种内吸性杀菌剂的使用可能对迁入的灰飞虱取食、产卵等行为产生的影响极小。水稻中RSV含量与病毒侵染率随着带毒灰飞虱取食时间的增加而提高。5种杀菌剂在田间常用浓度下,带毒灰飞虱取食水稻6d后通过RT-PCR检测RSV侵染率,发现所有杀菌剂相对于各自溶剂对照均促进了水稻体内病毒的侵染和增殖。由于这几种杀菌剂在田间浓度下对灰飞虱的作用不大,说明这几种杀菌剂的使用促进了RSV对水稻的侵染,从而增加了水稻发病率。杀菌剂对水稻某些抗病性基因表达的抑制,可能是促进发病的原因之一。水杨羟肟酸(salicylhydroxamic acid,SHAM)可以抑制植物对病毒的抗性,推测存在一条SA诱导的抗病毒途径,其受SHAM抑制,称为SHAM敏感途径(SHAM-sensitive pathway),它独立于PR蛋白合成途径。通过转录组测序研究SHAM处理水稻和油菜叶片后,分析处理组与对照组基因的差异表达情况,发现表达差异显着的基因多数与植物抗性途径有关。通过分析两种植物中上调、下调一致的基因类型,以及SHAM对水杨酸、茉莉酸及乙烯信号转导途径的影响,从而增进SHAM对植物抗性的调控的了解,以便促进病毒抗性研究。为建立一种RSV直接侵染水稻的方法,进行了一些探索性研究。通过人工造成水稻微伤口,以来源于带病毒灰飞虱研磨液、水稻研磨液、水稻中提纯的RSV为毒源,结合不同p H缓冲体系(乙酸-乙酸钠缓冲液p H 4.0,MES-KOH p H 5.7,磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液p H 5.0,磷酸盐缓冲液p H 7.5、p H 6.0)、不同溶质(聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、Ca Cl2、甘露醇、SHAM)的溶液浸渍水稻伤口,改变光照条件等处理水稻伤口处,通过RT-PCR检测发现均未成功接种RSV。

燕照玲,段俊枝,冯丽丽,陈海燕,齐红志,杨翠苹,施艳,任银玲,刘毓侠[10](2017)在《玉米抗病毒基因工程研究进展》文中研究表明病毒病是导致玉米产量降低和品质下降的主要原因之一。在我国,玉米矮花叶病和粗缩病发生范围最广、危害最严重。基因工程技术可人为将抗性基因或部分片段定向导入植物获得转基因抗病毒植株,具有速度快、效率高等优点,在玉米抗病毒育种中具有重要的应用价值。文章在总结我国主要玉米病毒病及其病原种类的基础上,论述采用不同策略培育抗病毒玉米植株的研究进展,其中,利用植物病毒基因序列的策略有病毒编码蛋白基因介导的抗病性、RNA干扰(RNAi)介导的抗病性、人工小RNA(amiRNA)介导的抗病性3种,还可利用非植物病毒基因,包括寄主的抗性基因及来自其他植物、动物和微生物的抗病毒基因如核糖体失活蛋白、核酸酶、2-5A体系的基因等;最后分析各种策略的优缺点及抗病毒转基因玉米的安全性问题,为科研工作者优化玉米抗病毒育种工程、培育生产上可推广的抗病毒品种提供参考。

二、植物病毒细胞间运动及运动蛋白基因介导的抗病性研究进展(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、植物病毒细胞间运动及运动蛋白基因介导的抗病性研究进展(论文提纲范文)

(1)NbFLA34和NbHRLI4基因在芜菁花叶病毒侵染过程中的功能研究(论文提纲范文)

英文缩略表
致谢
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒研究概述
        1.1.1 Potyvirus的发生危害
        1.1.2 Potyvirus的基因组结构特征
        1.1.3 芜菁花叶病毒(TuMV)编码蛋白的功能研究进展
    1.2 类成束阿拉伯半乳糖蛋白(Fasciclin-like arabinogalactan,FLA)研究概述
        1.2.1 FLA的分类地位与结构特征
        1.2.2 FLA在生长发育过程中的作用
        1.2.3 FLA在应对非生物胁迫中的作用
        1.2.4 FLA在应对生物胁迫中的作用
    1.3 植物过敏性反应诱导的细胞坏死
        1.3.1 植物过敏性反应诱导的细胞坏死
        1.3.2 植物水杨酸介导的植物细胞坏死
        1.3.3 植物病毒与过敏性反应
        1.3.4 植物类过敏反应病变诱导蛋白(HR-like lesion-inducing protein,HRLI)
    1.4 研究目的与意义
第二章 本氏烟NbFLA家族全基因组鉴定
    2.1 实验材料
        2.1.1 材料
        2.1.2 供试菌株及载体
    2.2 仪器与试剂
        2.2.1 试剂
        2.2.2 仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 植物总RNA提取
        2.3.2 基因组DNA去除与RNA逆转录
        2.3.3 克隆载体的构建
        2.3.4 表达载体构建
        2.3.5 农杆菌转化与浸润本氏烟
        2.3.6 病毒接种与接种后观察
        2.3.7 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)
        2.3.8 亚细胞定位实验
        2.3.9 家族全基因组鉴定
        2.3.10 系统进化分析和多序列联配
        2.3.11 基因结构与保守结构域分析
        2.3.12 启动子顺式作用元件与转录因子预测
    2.4 结果与分析
        2.4.1 NbFLA基因家族成员的全基因组鉴定
        2.4.2 NbFLA基因家族成员的进化分析与多序列联配
        2.4.3 NbFLA基因家族成员的结构与保守基序分析
        2.4.4 NbFLA基因家族成员的顺式作用元件与转录因子预测
        2.4.5 NbFLA蛋白家族成员的亚细胞定位分析
        2.4.6 NbFLA基因家族成员的组织特异性分析
        2.4.7 NbFLA基因家族成员响应生物胁迫的表达量分析
    2.5 讨论
        2.5.1 FLA基因家族的分类及特征
        2.5.2 FLA基因家族的表达模式及其作用
第三章 NbFLA34通过干扰TuMV 6K2蛋白的自身互作参与寄主抵抗TuMV侵染的过程
    3.1 实验材料
        3.1.1 材料
        3.1.2 供试菌株与载体
    3.2 试剂与仪器
        3.2.1 试剂
        3.2.2 仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 酵母双杂交(Yeast two hybrid,Y2H)
        3.3.2 双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)
        3.3.3 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)
        3.3.4 病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)
        3.3.5 Western blotting
        3.3.6 烟草遗传转化——叶盘法
        3.3.7 CTAB法抽提植物DNA
        3.3.8 转基因烟草鉴定
        3.3.9 苯胺蓝染色
        3.3.10 表达载体的构建
        3.3.11 病毒接种与接种后观察
    3.4 结果与分析
        3.4.1 NbFLA34与TuMV 6K2蛋白互作
        3.4.2 NbFLA34定位于细胞质膜并在TuMV侵染后显着下调
        3.4.3 GPI信号和GxxxG基序是NbFLA34与TuMV 6K2互作的关键位点
        3.4.4 NbFLA34沉默促进TuMV的侵染
        3.4.5 TuMV的积累在拟南芥突变体fla2中显着增加
        3.4.6 过表达NbFLA34阻碍了病毒的积累和胞间运动
        3.4.7 GxxxG基序是TuMV 6K2自身互作的关键位点
        3.4.8 NbFLA34干扰6K2的自身互作
        3.4.9 NbFLA34阻碍病毒囊泡的形成和PD靶向
        3.4.10 NbFLA34与四种potyviruses 6K2相互作用
    3.5 讨论
        3.5.1 NbFLA34在TuMV侵染过程中的生物学功能
        3.5.2 6K2诱导的病毒囊泡及GxxxG基序
        3.5.3 GPI锚定信号在NbFLA34功能中的作用
第四章 NbHRLI4依赖于SA途径调控细胞坏死和对TuMV的抗病性
    4.1 材料
    4.2 试剂与仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 酵母双杂交
        4.3.2 双分子荧光互补
        4.3.3 免疫共沉淀
        4.3.4 VIGS
        4.3.5 实时荧光定量PCR
        4.3.6 Western blotting
        4.3.7 台盼蓝染色鉴定细胞坏死
        4.3.8 H_2O_2检测
        4.3.9 电解质渗透率测定
        4.3.10 SA喷施
        4.3.11 基因家族的生物信息学分析
    4.4 结果与分析
        4.4.1 NbHRLI家族成员的全基因组鉴定
        4.4.2 NbHRLI家族成员的表达模式
        4.4.3 NbHRLI4沉默增加TuMV的积累
        4.4.4 瞬时表达NbHRLI4正调节寄主对TuMV的抗性
        4.4.5 NbHRLI4依赖于SA途径诱导HR样细胞死亡
        4.4.6 NbHRLI4依赖于SA调控寄主免疫
        4.4.7 NbHRLI4与TuMV-P3相互作用并响应TuMV-P3的表达
        4.4.8 NbHRLI4的四个膜互作区域对其与TuMV-P3的互作及其介导的坏死与抗病毒能力至关重要
    4.5 讨论
        4.5.1 NbHRLI4的表达量变化及其与P3的互作
        4.5.2 SA在NbHRLI4介导的防御反应中的作用
第五章 总结与展望
    5.1 结论
        5.1.1 NbFLA34在TuMV侵染过程中的作用
        5.1.2 NbHRLI4在TuMV侵染过程中的作用
    5.2 展望
        5.2.1 TuMV对于NbFLA34的下调机制的探索
        5.2.2 NbFLA34对于抵御potyviruses侵染的普遍性探索
        5.2.3 NbHRLI4参与细胞坏死的其他途径的探索
    5.3 创新点
参考文献
附录
    附录A:本研究中常用培养基与缓冲液的配制
        1. 抗生素配制
        2. Western blotting缓冲液
        3. 培养基配制
        4. 转基因材料培养的相关母液配方
        5. 其它试剂的配制
    附录B:本研究中使用的引物及其序列
作者简介
    参与的课题
    发表的论文

(2)蛋白酶抑制子NbSIPI6在植物抗PVY病毒中的作用(论文提纲范文)

摘要
Abstract
缩写说明
第一章 文献综述
    1 植物抗病毒的分子机制
        1.1 植物病毒病
        1.2 植物抗病毒的分子机制
        1.2.1 R基因介导的抗病毒机制
        1.2.2 基因沉默介导的抗病毒机制
    2.马铃薯Y病毒的研究进展
        2.1 马铃薯Y病毒
        2.2 基因组结构
        2.2.1 辅助成分蛋白酶HC-Pro
    3.蛋白酶抑制子(PI)在抗病中的研究进展
    4.研究目的及意义
第二章 NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300载体构建及本氏烟遗传转化
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 材料
        2.2 试剂和培养基
        2.3 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300融合载体的构建
        2.3.1 NbSIPI6-pGEM T-Easy、NbSIPI6m-pGEM T-Easy及GFP-1300质粒的提取
        2.3.2 目的载体的双酶切
        2.3.3 NbSIPI6、NbSIPI6m片段及GFP-1300片段凝胶回收
        2.3.4 连接与转化
        2.3.5 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300载体的验证及测序
        2.3.6 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300载体质粒提取
        2.3.7 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300载体双酶切验证
        2.4 农杆菌GV3101的转化
        2.4.1 制备农杆菌感受态细胞
        2.4.2 质粒转化农杆菌
        2.5 载体遗传转化本氏烟
        2.5.1 无菌播种本氏烟
        2.5.2 扩大培养含表达载体的农杆菌菌液
        2.5.3 预培养
        2.5.4 烟草愈伤侵染共培养
        2.5.5 烟草愈伤组织菌体洗涤及筛选
        2.5.6 分化培养
        2.5.7 生根培养
        2.5.8 炼苗及种植
        2.6 转基因烟草的验证
        2.6.1 转基因烟草幼苗PCR鉴定
        2.6.2 T0代转基因烟草PCR鉴定
        2.7 实时定量PCR分析Nb SIPI6 的表达量
        2.7.1 转基因烟草RNA的提取
        2.7.2 靶基因cDNA一链的合成
        2.7.3 实时荧光定量PCR检测T0代转基因苗的相对表达量
    3 结果分析
        3.1 超表达NbSIPI6、点突变NbSIPI6m融合载体的构建
        3.2 转基因植株的获得
        3.3 转基因烟草植株鉴定
        3.4 实时定量PCR分析Nb SIPI6 的表达
    4 讨论
第三章 Nb SIPI6-GFP与 Nb SIPI6m-GFP转基因植株的抗病性分析
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 材料
        2.2 试剂与培养基
        2.3 转基因烟草T1代抗生素抗性筛选
        2.4 T1代转基因株系GFP荧光检测
        2.5 转基因株系的抗病性分析
        2.5.1 转基因株系接种PVX-INF1病毒
        2.5.2 转基因株系接种PVY病毒
    3 结果与分析
        3.1 转基因烟草T1代抗生素抗性筛选
        3.2 T1代转基因株系GFP荧光检测
        3.3 转基因烟草抗病性分析
        3.3.1 转基因株系接种PVX-INF1 的表型
        3.3.2 转基因株系接种PVY病毒后的表型
        3.3.3 转基因株系接种PVY后 Nb SIPI6 的表达模式
    4 讨论
第四章 NbSIPI6 的亚细胞定位及表达特点
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
        2.2 试剂与培养基
        2.3 实验方法
        2.3.1 亚细胞定位
        2.3.2 Nb SIPI6受外源水杨酸的诱导表达
        2.3.3 Nb SIPI6受PVX病毒的诱导表达
    3 结果与分析
        3.1 亚细胞定位
        3.2 NbSIPI6 受外源水杨酸(SA)的诱导表达
        3.3 NbSIPI6受PVX的诱导表达
    4 讨论
第五章 NbSIPI6对基因沉默的抑制作用
    1 前言
    2 材料与实验方法
        2.1 材料
        2.2 试剂与培养基
        2.3 实验方法
        2.3.1 烟草材料培养
        2.3.2 农杆菌GV3101的转化
        2.3.3 农杆菌扩大培养
        2.3.4 农杆菌瞬时表达16c转基因烟草
        2.3.5 检测NbSIPI6是否具有抑制沉默抑制子的活性
    3 结果与分析
    4 讨论
第六章 讨论与展望
    1 研究讨论
    2 研究展望
参考文献
致谢
攻读学位期间取得的研究成果

(3)NbH2B和NbFD1基因在马铃薯X病毒侵染过程中的功能研究(论文提纲范文)

中文摘要
英文摘要
第一章 文献综述
    1.1 马铃薯X病毒
    1.2 本氏烟组蛋白H2B概述
    1.3 本氏烟铁氧化还原蛋白FD1的概述
    1.4 植物抗病机制概述
        1.4.1 植物的主要抗病毒机制
        1.4.2 水杨酸参与植物抗病毒病
        1.4.3 脱落酸参与植物抗病毒病
        1.4.4 胼胝质参与植物抗病毒病
    1.5 研究目的与意义
第二章 组蛋白H2B参与本氏烟对马铃薯X病毒抗性作用
    2.1 试验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 供试菌株和载体
        2.1.3 试验用试剂
    2.2 试验方法
        2.2.1 植物总RNA提取
        2.2.2 反转录合成cDNA
        2.2.3 基因扩增
        2.2.4 TRV介导VIGS载体构建
        2.2.5 热击转化大肠杆菌
        2.2.6 质粒抽提
        2.2.7 电击转化根癌农杆菌
        2.2.8 农杆菌共浸润本氏烟
        2.2.9 病毒摩擦接种
        2.2.10 半定量PCR
        2.2.11 实时荧光定量PCR
        2.2.12 Western blotting检测
        2.2.13 水杨酸含量测定
    2.3 试验结果
        2.3.1 H2B基因的克隆及序列分析
        2.3.2 H2B的组织特异性表达
        2.3.3 PVX侵染的本氏烟中H2B的积累量减少
        2.3.4 H2B沉默后叶片形态异常并且叶柄和茎坏死
        2.3.5 H2B沉默抑制了PVX在本氏烟上的积累
        2.3.6 H2B沉默使植物激素SA的积累增加
        2.3.7 阻断SA合成途径后H2B沉默植株叶柄和茎的坏死减轻
        2.3.8 H2B沉默植株中内源SA的积累促进了植物RNA沉默途径
    2.4 讨论
第三章 FD1参与本氏烟应对马铃薯X病毒侵染的多重响应
    3.1 试验材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 供试菌株和载体
        3.1.3 试验用试剂
    3.2 试验方法
        3.2.1 酵母双杂交
        3.2.2 双分子荧光互补
        3.2.3 免疫共沉淀
        3.2.4 Western blotting检测
        3.2.5 qRT-PCR检测
        3.2.6 Nortem blotting检测
        3.2.7 叶绿素含量检测
        3.2.8 胼胝质体积量分析
        3.2.9 叶片组织切片和观察
        3.2.10 胞间连丝通透性分析
        3.2.11 外源施加植物激素
        3.2.12 ABA和SA激素含量测定
        3.2.13 原生质体制备及转染
    3.3 试验结果
        3.3.1 FD1基因的克隆及序列分析
        3.3.2 FD1的细胞定位
        3.3.3 FD1与PVX p25互作
        3.3.4 PVX或者p25蛋白表达诱导FD1积累量下调
        3.3.5 FD1沉默后植物生理变化
        3.3.6 FD1沉默有利于PVX的侵染
        3.3.7 FD1系统沉默促进PVX细胞间的运动和复制
        3.3.8 FD1系统沉默胼胝质积累量降低
        3.3.9 FD1沉默植株中ABA和SA激素含量降低
        3.3.10 过表达FD1提高植物对PVX的抗性
    3.4 讨论
第四章 全文总结与创新点
    4.1 结论
        4.1.1 组蛋白H2B参与本氏烟对马铃薯X病毒的抗性作用
        4.1.2 FD1参与本氏烟对马铃薯X病毒侵染的多重响应
    4.2 创新点
        4.2.1 组蛋白H2B与植物病毒PVX的联系
        4.2.2 FD1参与植物抵抗PVX侵染过程
参考文献
致谢
攻读学位论文期间发表文章

(4)中国小麦花叶病毒(CWMV)外壳蛋白(CP)磷酸化及其作用机理研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 中国小麦花叶病毒研究进展
        1.1.1 CWMV田间症状
        1.1.2 CWMV基因组结构及其编码蛋白
        1.1.2.1 CWMV 基因组结构
        1.1.2.2 病毒复制酶(Viral Replicase)
        1.1.2.3 运动蛋白(MP)
        1.1.2.4 外壳蛋白及其相关蛋白
        1.1.2.5 富含半胱氨酸的蛋白(CRP)
    1.2 叶绿体与病毒的关系研究进展
        1.2.1 病毒侵染对叶绿体的影响
        1.2.2 叶绿体在病毒侵染过程中所发挥的作用
    1.3 研究的目的与意义
第二章 CWMV CP转基因烟草的获得及其抗性研究
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验方法
        2.2.2.1 引物设计
        2.2.2.2 构建 PCV-GFP 表达载体
        2.2.2.3 烟草叶片总蛋白的提取
        2.2.2.4 Western Blot检测
        2.2.2.5 DNA的提取与检测
        2.2.2.6 农杆菌浸润接种
        2.2.2.7 Total RNA的提取
        2.2.2.8 cDNA的合成
        2.2.2.9 实时荧光定量PCR
        2.2.2.10 净光合速率检测
    2.3 结果与分析
        2.3.1 转基因苗的获得
        2.3.2 CP转基因烟草出现花叶与矮化表型
        2.3.3 转基因烟草净光合速率检测
        2.3.4 表达CP蛋白基因提高烟草对CWMV的抗病性
    2.4 小结与讨论
第三章 CWMV CP的定位分析
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验方法
        3.2.2.1 引物设计
        3.2.2.2 构建PCV-GFP表达载体
        3.2.2.3 农杆菌感受态细胞的制备
        3.2.2.4 重组质粒转化农杆菌
        3.2.2.5 农杆菌浸润接种
        3.2.2.6 荧光观察
        3.2.2.7 烟草叶片总蛋白的提取
        3.2.2.8 烟草叶片叶绿体蛋白的提取
        3.2.2.9 Western blot检测表达蛋白
        3.2.2.10 低温包埋
        3.2.2.11 胶体金间接标记
        3.2.2.12 电镜观察拍照
    3.3 结果与分析
        3.3.1 CWMV的 CP、NCP、CPRT蛋白亚细胞定位分析
        3.3.2 CWMV的 CP、NCP、CPRT蛋白免疫胶体金定位分析
        3.3.3 CWMV CP关键区域亚细胞定位分析
        3.3.4 CWMV CP信号肽预测
    3.4 结果与讨论
第四章 CP蛋白进入叶绿体的机理研究
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验方法
        4.2.2.1 引物设计
        4.2.2.2 免疫沉淀
        4.2.2.3 Western blot检测
        4.2.2.4 PCV-GFP表达载体的构建
        4.2.2.5 重组质粒转化农杆菌
        4.2.2.6 农杆菌浸润接种
        4.2.2.7 荧光观察
        4.2.2.8 酵母载体的构建
        4.2.2.9 酵母接合法(yeast mating)筛库
        4.2.2.10 酵母质粒的提取
        4.2.2.11 酵母质粒转化大肠杆菌DH5α
        4.2.2.12 阳性克隆的筛选和酵母菌落PCR检测
        4.2.2.13 叶绿体蛋白PSID2克隆载体的构建
        4.2.2.14 PSID2、CP酵母载体的构建
        4.2.2.15 酵母双杂交
    4.3 结果于分析
        4.3.1 CWMV CP蛋白修饰位点分析
        4.3.2 CP蛋白突变体的定位分析
        4.3.3 与CWMV CP蛋白互作的烟草寄主因子筛选
        4.3.4 CWMV CP与 NbPSID2 互作分析
        4.3.5 在本氏烟中沉默NbPSID2 基因
    4.4 小结与分析
第五章 总结与展望
    5.1 总结
    5.2 展望
参考文献
附录
    载体图谱
    主要试剂
    主要仪器
    常用培养基配方
    试剂的配制
    抗生素配方
    常用英文缩写的中英文对照及全称
致谢
作者简介

(5)番茄斑萎病毒胞间移动和抗病蛋白Sw-5b抑制病毒移动的机制研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1 番茄斑萎病毒病的概述
        1.1 番茄斑萎病毒的分布与田间危害
        1.2 番茄斑萎病毒基因组
        1.3 番茄斑萎病毒的复制和转录
        1.4 番茄斑萎病毒的胞间移动
    2 Sw-5b抗性蛋白和植物分子伴侣概述
        2.1 Sw-5b抗性蛋白概述
        2.2 植物分子伴侣与抗病毒研究
    3 植物细胞壁与转录因子WRKY概述
        3.1 植物细胞壁的结构和功能
        3.1.1 植物细胞壁的结构
        3.1.2 植物细胞壁的组成成分
        3.1.3 植物细胞壁在植物免疫中的作用
        3.1.4 植物细胞壁在微生物互作过程中的作用
        3.2 WRKY转录因子的分类与生物学功能
        3.2.1 WRKY转录因子的定义与分类
        3.2.2 WRKY转录因子在植物免疫中的调控作用
第二章 分子共伴侣SGT1对番茄斑萎病毒在本氏烟中的胞间移动和系统侵染具有重要调控作用
    1 实验材料与方法
        1.1 实验植物材料与毒源保存
        1.2 构建载体引物
        1.3 实验试剂
        1.4 植物RNA的提取以及纯化
        1.5 RNA反转录
        1.6 载体构建
        1.6.1 片段扩增
        1.6.2 片段回收
        1.6.3 酶切
        1.6.4 载体片段连接
        1.6.5 连接产物转化
        1.6.6 阳性克隆的筛选
        1.6.7 质粒提取
        1.7 质粒电转
        1.8 农杆菌处理
        1.9 蛋白质印迹法检测蛋白
        1.10 双分子荧光互补实验
        1.11 免疫共沉淀
        1.12 实时定量PCR (qRT-PCR)检测
    2 结果与分析
        2.1 TSWV移动蛋白NSm与分子共伴侣NbSGT1相互作用
        2.2 TSWV侵染后NbSGT1明显上调并且该蛋白增强病毒的侵染能力
        2.3 NbSGT1的沉默抑制TSWV NSm的胞间运动
        2.4 沉默NbSGT1抑制TSWV在本氏烟中的局部侵染和系统感染
        2.5 NbSGT1正调控美洲型和亚洲型番茄斑萎病毒在本氏烟中的侵染
    3 讨论
第三章 番茄抗病蛋白Sw-5b抑制病毒移动的机制研究
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 基因组提取
        1.3 载体构建
        1.4 质粒电转以及农杆菌处理
        1.5 蛋白质印迹法检测蛋白
        1.6 实时定量PCR(qRT-PCR)检测
        1.7 蛋白原核表达
        1.8 凝胶迁移实验(EMSA)
        1.9 荧光素酶报告基因表达体系实验
        1.10 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附法
    2 结果与分析
        2.1 Sw-5b抑制番茄斑萎病毒NSm的胞间移动
        2.2 Sw-5b与NSm诱导的免疫反应大规模下调细胞壁相关基因的表达
        2.3 预测细胞壁相关基因启动子有WRKY结合位点
        2.4 WKRY40和75与细胞壁相关基因启动子相结合
        2.5 NbWRKY40与NbWRKY75的亚细胞定位
        2.6 WRKY40和WRKY75过表达显着下调细胞壁相关基因启动子的表达
        2.7 WRKY40和WRKY75的沉默减弱Sw-5b与NSm诱导的细胞壁基因下调
        2.8 Sw-5b诱导的WRKYs上调与JA信号通路相关,但与SA信号通路无关
        2.9 WRKY的沉默导致Sw-5b对TSWV的抗性丧失
    3 讨论
全文总结
    1 全文总结
        1.1 分子伴侣蛋白SGT1对本氏烟草中番茄斑萎病毒的胞间移动和系统侵染至关重要
        1.2 番茄抗病蛋白Sw-5b抑制病毒移动和侵染的机制研究
    2 本研究创新点
参考文献
附录A 光照对番茄斑萎病毒侵染影响的初步研究
附录B 本论文缩写词及中文对照
附录C 载体构建及引物信息
附录D 常用抗生素及试剂的配制方法
研究生期间发表的学术论文
致谢

(6)毒氟磷与马铃薯X病毒侵染关系研究及致病因子p25互作蛋白筛选(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第一章 研究进展
    1.1 植物抗病毒药剂
        1.1.1 毒氟磷
        1.1.2 其他药剂及衍生物
    1.2 马铃薯X病毒
        1.2.1 PVX的基因组结构
        1.2.2 PVX的发生和分布及防治技术
    1.3致病因子p25
    1.4 研究目的与意义
第二章 毒氟磷对PVX预防作用的研究分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 供试植株
        2.1.2 供试菌株及载体
        2.1.3 试剂与仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 Trizol法提取总RNA
        2.2.2 反转录
        2.2.3 本氏烟草的准备
        2.2.4 蛋白Western Blot杂交
        2.2.5 实时荧光定量分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 毒氟磷预处理影响PVX在本氏烟上的发病率
        2.3.2 毒氟磷预处理对PVX病毒积累的影响
    2.4 小结
第三章 毒氟磷对PVX治愈作用的研究分析
    3.1 实验材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 Trizol法提取总RNA
        3.2.2 反转录
        3.2.3 本氏烟草的准备
        3.2.4 蛋白Western Blot杂交
        3.2.5 实时荧光定量分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 毒氟磷处理对发病植株中的PVX积累的影响
        3.3.2 毒氟磷在治愈处理中对PVX病毒蛋白表达量的影响
    3.4 小结
第四章 致病因子p25互作蛋白的筛选验证
    4.1 实验材料
        4.1.1 供试植株和菌株
        4.1.2 试剂与仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)
        4.2.2 目的基因的扩增
        4.2.3 PCR扩增产物电泳回收
        4.2.4 T载体连接
        4.2.5 质粒纯化提取
        4.2.6 大肠杆菌感受态制备
        4.2.7 Gateway克隆技术构建载体
        4.2.8 热激转化
        4.2.9 阳性菌落筛选及序列测定和分析
        4.2.10 农杆菌感受态制备与电击转化
        4.2.11 农杆菌共浸润本氏烟
        4.2.12 双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence complementatuon,Bi FC)
    4.3 实验结果
        4.3.1 GFP磁珠共沉淀与p25相互作用的蛋白
        4.3.2 质谱鉴定结果分析
        4.3.3 PVX Rd Rp与 p25的Bi FC互作验证
        4.3.4 SGS3 家族蛋白与 PVX 侵染关系分析
    4.4 小结
第五章 讨论
第六章 展望
    6.1 毒氟磷抑制PVX侵染的作用机制
    6.2 与p25互作蛋白分析
参考文献
致谢
附录
符号及缩略语说明
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(7)赤爮花叶病毒外壳蛋白基因对马铃薯的转化及其抗病性初步分析(论文提纲范文)

摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 赤爮花叶病毒的概况
    1.2 马铃薯Y病毒属病毒外壳蛋白功能概况
        1.2.1 CP参与病毒的蚜传
        1.2.2 CP参与病毒的长距离运动和胞间运动
        1.2.3 CP参与植物病毒病防治
        1.2.4 CP参与病毒症状表达
    1.3 植物抗病毒基因工程研究概况
        1.3.1 蛋白介导的抗性
        1.3.2 RNA介导的抗性
    1.4 本研究的意义
2 赤爮花叶病毒CP蛋白基因的获得及鉴定
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 引物设计与合成
    2.2 主要仪器与试剂
        2.2.1 主要仪器设备
        2.2.2 主要试剂及其配制
        2.2.3 赤爮总RNA的获得
        2.2.4 第一链cDNA的合成
        2.2.5 赤爬花叶病毒CP目的条带的扩增
        2.2.6 目的条带的电泳检测及纯化回收
        2.2.7 目的基因与pMD18-T载体的连接
        2.2.8 重组质粒的克隆转化
        2.2.9 重组质粒的小量提取
        2.2.10 目的基因的测序与结果分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 赤爮总RNA提取
        2.3.2 ThDMV CP基因的RT-PCR检测
        2.3.3 ThDMV CP基因PCR产物的纯化
        2.3.4 pMD18T载体菌液PCR检测
        2.3.5 赤爮花叶病毒CP核酸序列比对分析
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
3 赤爮花叶病毒CP基因侵染性克隆载体的构建
    3.1 实验材料
        3.1.1 载体与菌株
        3.1.2 植物材料
        3.1.3 引物设计与合成
    3.2 仪器和试剂
        3.2.1 主要仪器设备
        3.2.2 主要试剂及其配置
    3.3 实验方法
        3.3.1 中间重组质粒pMD18T-CP的提取
        3.3.2 植物内表达载体及ThDMV CP片段的酶切
        3.3.3 植物内双元表达载体的构建
        3.3.4 重组植物内双元表达载体的大肠杆菌转化及培养
        3.3.5 重组植物内双元表达载体的克隆培养及阳性检测
        3.3.6 正确克隆质粒提取
        3.3.7 重组植物内双元表达载体的酶切检测
        3.3.8 序列测序
        3.3.9 农杆菌感受态制备
        3.3.10 农杆菌的电击转化
    3.4 结果与分析
        3.4.1 ThDMV CP基因BamHⅠ和HindⅢ酶切位点添加
        3.4.2 植物内双元表达载体pCAMBIA1301-Cp正确性检测
        3.4.3 植物内双元表达载体pCAMBIA1300-Cp正确性检测
        3.4.4 植物内双元表达载体pGreen-35sCP正确性检测
        3.4.5 农杆菌转化结果检测
    3.5 讨论
    3.6 本章小结
4 赤爮花叶病毒CP基因的初步定位及抗病性分析
    4.1 实验材料
        4.1.1 病毒与菌体
        4.1.2 引物设计与合成
    4.2 仪器和试剂
        4.2.1 主要仪器
        4.2.2 主要试剂及配置
    4.3 实验方法
        4.3.1 农杆菌浸润接种马铃薯
        4.3.2 ThDMV CP侵染马铃薯情况初步探查
        4.3.3 ThDMV CP侵染马铃薯定位情况初步探查
        4.3.4 全组织杂交
        4.3.5 马铃薯瞬时表达CP后叶片中粗酶液的提取
        4.3.6 过氧化氢酶CAT的测定
        4.3.7 过氧化物酶POD的测定
        4.3.8 超氧化物歧化酶SOD的测定(NBT)
        4.3.9 PVY摩擦接种瞬时表达ThDMV CP的马铃薯
        4.3.10 荧光定量PCR检测ThDMV CP对PVY感染马铃薯的影响
    4.4 结果与分析
        4.4.1 ThDMV-CP侵染性情况初步探查
        4.4.2 植物内表达重组载体pCAMBIA1301-Cp荧光原为杂交检测
        4.4.3 植物内表达重组载体pCAMBIA1301-Cp全组织杂交检测
        4.4.4 赤爮花叶病毒CP对植物防御酶的影响
        4.4.5 实时定量RT-PCR检测结果
    4.5 讨论
    4.6 本章小结
结论
参考文献
附录1
附录2
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
附件

(8)实时荧光定量和等温核酸扩增检测莲藕潜隐病毒技术的建立与应用(论文提纲范文)

摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
    1 莲藕病毒病研究进展
        1.1 莲藕潜隐病毒
        1.2 黄瓜花叶病毒
        1.3 莲藕条斑病毒
        1.4 芋花叶病毒
        1.5 苹果茎沟病毒
    2 植物病毒检测技术研究进展
        2.1 生物学检测法
        2.2 电子显微镜检测
        2.3 血清学检测
        2.4 分子生物学检测
    3 植物病毒运动研究进展
        3.1 植物病毒胞间运输研究
        3.2 植物病毒长距离运输分子机理
    4 研究目的及意义
第二章 莲藕潜隐病毒检测体系的建立
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 结果与分析
        2.1 RT-PCR鉴定
        2.2 实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立
        2.3 LAMP检测体系的建立
        2.4 RT-RPA检测体系的建立
    3 讨论
第三章 莲藕潜隐病毒在“僵藕”中的分布研究
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 结果与分析
        2.1 “僵藕”顶芽中莲藕潜隐病毒的分布
        2.2 “僵藕”主茎中莲藕潜隐病毒的分布
        2.3 “僵藕”侧茎中莲藕潜隐病毒的分布
        2.4 6株“僵藕”中莲藕潜隐病毒的浓度分析
    3 讨论
全文结论
参考文献
致谢
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(9)杀菌剂对水稻条纹叶枯病毒侵染水稻的影响及水杨羟肟酸处理水稻和油菜叶片的转录组分析(论文提纲范文)

致谢
摘要
Abstract
第1章 文献综述
    1.1 水稻条纹叶枯病概述
        1.1.1 水稻条纹叶枯病的发生分布
        1.1.2 水稻条纹叶枯病症状
        1.1.3 水稻条纹叶枯病的传毒介体及其特性
        1.1.4 水稻条纹病毒的寄主范围
        1.1.5 水稻条纹叶病毒的基本特性
        1.1.6 水稻条纹病毒的致病性分化和分子变异
        1.1.7 水稻条纹叶枯病的防治和研究难点
    1.2 水杨羟肟酸简介
    1.3 研究的目的及意义
        1.3.1 研究几种内吸性杀菌剂对粳稻响应灰飞虱取食及水稻条纹病毒侵染的影响的意义
        1.3.2 研究水杨羟肟酸处理对水稻和油菜叶片转录组的影响的意义
        1.3.3 水稻条纹病毒直接侵染水稻的方法研究的意义
第2章 几种内吸性杀菌剂对粳稻响应灰飞虱取食及水稻条纹病毒侵染的影响
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 主要生化试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 供试内吸性杀菌剂
        2.1.5 试验方法
    2.2 结果与分析
        2.2.1 供试水稻STV11目的基因的检测
        2.2.2 水稻条纹病毒及水稻、灰飞虱内参基因检测
        2.2.3 杀菌剂对灰飞虱的忌避性
        2.2.4 杀菌剂对灰飞虱的存活率的影响
        2.2.5 杀菌剂对病毒侵染的影响
        2.2.6 杀菌剂对水稻抗病性基因的影响
    2.3 讨论
第3章 水杨羟肟酸处理对水稻和油菜叶片转录组的影响
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 水杨羟肟酸处理水稻和油菜叶片的方法
        3.1.3 转录组测序
    3.2 结果与分析
        3.2.1 样品RNA质量检测
        3.2.2 原始数据预处理
        3.2.3 参考基因组比对统计
        3.2.4 基因差异表达分析
        3.2.5 差异基因GO富集性分析
        3.2.6 差异基因KEGG富集性分析
        3.2.7 涉及3 种信号途径的GO term
        3.2.8 两物种中共同差异表达的基因类型
    3.3 讨论
第4章 水稻条纹病毒直接侵染水稻的方法研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 主要生化试剂
        4.1.3 主要仪器
        4.1.4 水稻条纹病毒及水稻、灰飞虱内参基因的检测
        4.1.5 植物病毒的提纯与检测
        4.1.6 水稻条纹病毒直接侵染水稻试验方法
    4.2 结果与分析
        4.2.1 带毒灰飞虱及带毒水稻带毒情况检测
        4.2.2 病毒提纯结果检测
        4.2.3 水稻条纹病毒直接接种水稻试验结果
    4.3 讨论
第5章 总结和展望
参考文献
作者简历

(10)玉米抗病毒基因工程研究进展(论文提纲范文)

0 引言
1 我国玉米病毒病主要种类及其病原
    1.1 玉米矮花叶病及其病原
    1.2 玉米粗缩病及其病原
2 玉米抗病毒基因工程
    2.1 利用植物病毒基因序列
        2.1.1 第1代抗病毒转基因策略
        2.1.2 第2代抗病毒转基因策略
        2.1.3 第3代抗病毒转基因策略
    2.2 利用非病毒来源的抗病毒基因
        2.2.1 寄主抗病基因
        2.2.2 核糖体失活蛋白基因
        2.2.3 核酸酶基因
        2.2.4 其他抗病毒基因
3 展望

四、植物病毒细胞间运动及运动蛋白基因介导的抗病性研究进展(论文参考文献)

  • [1]NbFLA34和NbHRLI4基因在芜菁花叶病毒侵染过程中的功能研究[D]. 吴昕扬. 浙江大学, 2021(01)
  • [2]蛋白酶抑制子NbSIPI6在植物抗PVY病毒中的作用[D]. 刘敏. 浙江师范大学, 2020(01)
  • [3]NbH2B和NbFD1基因在马铃薯X病毒侵染过程中的功能研究[D]. 杨雪. 沈阳农业大学, 2019(08)
  • [4]中国小麦花叶病毒(CWMV)外壳蛋白(CP)磷酸化及其作用机理研究[D]. 杨锦. 湖南农业大学, 2019(01)
  • [5]番茄斑萎病毒胞间移动和抗病蛋白Sw-5b抑制病毒移动的机制研究[D]. 钱新. 南京农业大学, 2019(08)
  • [6]毒氟磷与马铃薯X病毒侵染关系研究及致病因子p25互作蛋白筛选[D]. 赵兴. 沈阳农业大学, 2019(03)
  • [7]赤爮花叶病毒外壳蛋白基因对马铃薯的转化及其抗病性初步分析[D]. 苗艳梅. 东北林业大学, 2019(01)
  • [8]实时荧光定量和等温核酸扩增检测莲藕潜隐病毒技术的建立与应用[D]. 吴伟文. 扬州大学, 2019(02)
  • [9]杀菌剂对水稻条纹叶枯病毒侵染水稻的影响及水杨羟肟酸处理水稻和油菜叶片的转录组分析[D]. 温雪玮. 浙江大学, 2018(04)
  • [10]玉米抗病毒基因工程研究进展[J]. 燕照玲,段俊枝,冯丽丽,陈海燕,齐红志,杨翠苹,施艳,任银玲,刘毓侠. 南方农业学报, 2017(12)

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运动蛋白基因介导的植物病毒细胞间运动和抗病性研究进展
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